稳定干扰长链非编码RNA LINC01224结直肠癌细胞株的建立及其对细胞凋亡的影响

李国丹，杨 勤，李秋燕，陈小谊，符伟玉，兰柳波，林小聪

结直肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病机制尚未完全清楚。据统计，结直肠癌发病率和病死率在中国恶性肿瘤中分别位居第3和第5位，并呈逐年上升趋势；中国已经成为全球结直肠癌每年新发病例数和死亡病例数最多的国家[1]。因此，研究结直肠癌发生与发展的分子机制，寻找结直肠癌潜在的治疗靶点，具有重要临床意义。

长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是片段长度大于200个核苷酸且无编码蛋白质能力的一类RNA分子，可在转录或转录后水平调控基因表达。近年来研究[2-5]表明，LINC01224在肝癌、卵巢癌、胃癌及口腔癌中发挥促癌作用，其表达上调可能是导致上述肿瘤发生发展的重要原因。研究[6]报道，LINC01224在结直肠癌发病机制中也起重要作用，下调LINC01224表达可抑制癌细胞增殖、侵袭及移植瘤生长。但LINC01224与结直肠癌细胞凋亡的关系尚不明确。该研究通过构建靶向干扰LINC01224的重组慢病毒载体，筛选出稳定且低表达LINC01224的LoVo和SW620细胞，并观察LINC01224对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响，为后续的机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料人结直肠癌细胞(LoVo、SW620、Caco2、THC-8307、COLO-205、RKO、DLD-1、HCT-116、SW480、HT-29)、正常结直肠上皮HCOEPic细胞及人肾胚HEK 293T细胞均由该课题组实验室保存。胎牛血清、RPMI-1640培养基、DMEM培养基(美国Hyclone公司)；DH5α感受态细胞(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)；TRIzol试剂、Opti-MEM培养基(美国Invitrogen公司)；PrimeScript RT试剂盒(日本TaKaRa公司)；SYBR Green qPCR SuperMix试剂盒(美国Invitrogen公司)；限制性核酸内切酶BamHI和Mulu(上海碧云天生物技术有限公司)；MTS试剂(美国Promega公司)；流式凋亡试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；Lipofectamine 3000、酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 正常结直肠上皮HCOEPic细胞、结直肠癌细胞(LoVo、SW620、Caco2、COLO-205、RKO、DLD-1、SW480、HT-29)培养于含10%胎牛血清(FBS)和1%青-链霉素的RPMI-1640培养基中；结直肠癌细胞(THC-8307、HCT-116)培养于含10% FBS和1%青-链霉素的高糖DMEM培养基中，所有细胞均培养于37 ℃、含5%CO2的培养箱中。

1.2.2生物信息学分析 使用GEPIA2(Gene Expression Profiling Interactive AnalysisGene Expression Profiling Interactive Analysis，http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)数据库分析LINC01224在结直肠癌中的表达情况。

1.2.3细胞转染 由美国Sigma公司合成3组针对LINC01224的小干扰RNA(siRNA)序列。根据Lipofectanmine 3000试剂说明书进行Lovo细胞转染。转染细胞分为siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组及对照组(siRNA-NC)，qPCR检测3种siRNA抑制细胞内LINC01224表达的情况。以干扰效果最显著的siRNA构建LINC01224的shRNA。下调LINC01224表达的siRNA序列如下：siRNA-1，(F)5′-TGGAATGTGTCCACATGGGdTdT-3′，(R)5′-CCCATGTGGACACATTCCAdTdT-3′； siRNA-2，(F)5′-TTCTCTCCTGCTTTGGTGCdTdT-3′，(R)5′-GCACCAAAGCAGGAGAGAAdTdT-3′； siRNA-3，(F)5′-AGCATTTAGGCCCACTACCdTdT-3′，(R)5′-GGTAGTGGGCCTAAATGCTdTdT-3′；siRNA-NC，(F)5′-GAACUGGGGUGCGUGUGAUdTdT-3′，(R)5′-AUCACACGCACCCCAGUUCdTdT-3′。

1.2.4RT-qPCR TRIzol法提取细胞总RNA，使用PrimeScript RT试剂盒进行逆转录反应，将RNA逆转录为cDNA。按照SYBR Green qPCR SuperMix试剂盒说明书进行qPCR分析，检测LINC01224的表达水平。以GAPDH作为内参照，采用2-ΔΔCt法计算LINC01224的相对表达量。引物序列：LINC01224，(F)5′- CCAGAGCTGTGCAGATGAGT-3′、(R)5′-CTGCAGCTTCGTCAGCAGGC-3′；GAPDH，(F)5′-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3′、(R)5′-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3′。

1.2.5LINC01224 shRNA慢病毒载体的构建及鉴定 选择LoVo细胞内干扰LINC02114表达效果最明显的siRNA序列，以“BamH I酶切位点+siRNA正义链+Loop环序列+siRNA反义链+MluI酶切位点”为原则对LINC01224的shRNA基因序列进行设计，苏州金唯智生物科技有限公司合成shRNA基因序列正义链和反义链。构建慢病毒载体的shRNA基因序列如下：sh-LINC01224，(F)5′-GATCCAG CATTTAGGCCCACTACCTTCAAGAGAGGTAGTGGGC CTAAATGCTTTTTTA-3′，(R)5′-CGCGTAAAAAAG CATTTAGGCCCACTACCTCTCTTGAAGGTAGTGGGC CTAAATGCTG-3′。混合等体积的正义链和反义链，金属浴煮沸5 min，随后72 ℃保温15 min，冷却至室温，所得为双链的LINC01224 shRNA基因序列。使用限制性核酸内切酶MluI和BamH I对pLent-U6-GFP-Puro载体进行双酶切，T4 DNA连接酶回收酶切产物，将其与shRNA基因序列进行连接反应(16 ℃，1 h)，获得pLent-U6-sh-LINC01224-GFP-Puro重组质粒，定义为sh-LINC01224组(对照组为pLent-U6-GFP-Puro空载质粒，定义为sh-NC组)。使用DH5α大肠埃希菌感受态细胞进行重组质粒转化，进行扩增后，将感受态细胞接种于LB琼脂培养基(含100 μg/ml氨苄青霉素)，37 ℃倒置培养16 h。挑取单个抗性菌接种于LB液体培养基中，继续培养扩增，通过质粒提取进行核酸测序鉴定。

1.2.6重组慢病毒包装及滴度测定 转染前，更换细胞培养基为无双抗完全培养基。使用Lipofectamine 3000试剂盒将病毒辅助包装质粒(pHelper 1.0及pHelper 2.0)和LINC01224的重组慢病毒质粒共转染至HEK 293T细胞，转染8～10 h后更换为完全培养基。继续培养48 h后进行离心，所得上清液使用0.45 μm滤器过滤，再高速离心(75 000 r/min )进行浓缩，0.22 μm过滤器过滤，即可得到高滴度重组慢病毒浓缩液。采用倍比稀释计数法进行慢病毒滴度测定。

1.2.7慢病毒感染靶细胞及嘌呤霉素筛选 将LoVo及SW620细胞浓度调整为7×104个/ml，接种于24孔板。待细胞汇合度长至30%～40%,加入重组慢病毒和终浓度为6 μg/ml的聚凝胺，混匀后常规培养8 h，更换为不含聚凝胺的完全培养基。培养24 h后，以含4 μg/ml嘌呤霉素的完全培养基连续筛选2周，获得抗性细胞克隆。

1.2.8单克隆稳定细胞株的建立 具有嘌呤霉素抗性的LoVo及SW620细胞经胰酶消化后重悬，调整细胞浓度为2 000～3 000个/ml，每孔100 μl接种于96孔板。有限稀释法筛选出单个且表达GFP的细胞，随后进行扩大培养。

1.2.9MTS检测 取对数生长期的细胞消化后，调整细胞浓度为每孔1×104个细胞，接种于96孔板。分别培养24、48、72和96 h，每孔加入10 μl CellTiter 96 AQ单溶液细胞增殖检测试剂，在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育4 h，然后置于酶标仪在490 nm波长处读取吸光度值。

1.2.10流式细胞术 取对数生长期的细胞进行消化重悬，每个样品收集5×105个细胞，PBS洗涤3次。离心弃上清液收集沉淀细胞。按照Annexin V-PE/7-AAD凋亡流式检测试剂盒说明书进行细胞凋亡检测，将收集的细胞重悬于结合缓冲液中，在细胞悬液中加入5 μl Annexin V PE，室温避光孵育5 min，随后加入10 μl 7-AAD，1 h内使用流式细胞仪检测细胞凋亡。

2 结果

2.1 结直肠癌组织和细胞中LINC01224的表达情况应用GEPIA2数据库对TCGA(The Cancer Genome Atlas)和GTEx(The Genotype Tissue Expression)中结直肠癌组织的LINC01224 RNA测序数据进行了分析。结果表明，LINC01224在结直肠癌组织中的表达(n=275)高于正常结直肠组织(n=349)(P<0.05)(图1A)。qPCR结果显示，与正常结直肠上皮细胞相比，LINC01224在10种结直肠癌细胞(包括LoVo、SW620、Caco2、THC-8307、COLO-205、RKO、DLD-1、HCT-116、SW480和HT-2细胞)中HCOEPic均呈高表达(t=81.01、77.34、41.46、47.14、41.20、47.73、94.43、112.58、56.8、100.24，P<0.01)(图1B)；其中以LoVo和SW620细胞其LINC01224的表达上调最为显著。因此，选择LoVo和SW620细胞进行后续实验。

2.2 筛选最佳干扰的siRNA片段qPCR结果显示，siRNA-1组、siRNA-2组和siRNA-3组针对LoVo细胞的LINC01224 RNA干扰效率分别为8%、75%和86%。与对照组比较，siRNA-2组和siRNA-3组LINC01224表达下调，差异有统计学意义(t=113.00、148.96，P<0.01)(图2)。其中，siRNA-3组的LINC01224表达下调最为显著。因此，选择siRNA-3构建shRNA慢病毒载体。

2.3 LINC01224 shRNA重组载体的鉴定与LINC01224 shRNA目标序列相比，插入序列未发生碱基插入、突变、缺失等情况，与目标序列完全一致(图3)，提示LINC01224 shRNA慢病毒载体构建成功。

图3 LINC01224 shRNA慢病毒载体测序结果

2.4 建立稳定靶向干扰LINC01224表达的LoVo和SW620结直肠癌细胞株荧光显微镜下sh-LINC01224组与对照组(sh-NC组)LoVo和SW620细胞生长状况良好，均可稳定表达绿色荧光(图4)。qPCR结果表明，sh-LINC01224组LINC01224表达水平较对照组降低，差异有统计学意义(t=85.21，52.37，P<0.01)，即成功构建稳定靶向下调LINC01224表达的LoVo和SW620结直肠癌细胞株。见图5。

图4 荧光显微镜下观察稳定靶向干扰LINC01224表达的LoVo和SW620结直肠癌细胞株 ×200

图5 qPCR检测LoVo和SW620稳定干扰细胞株中LINC01224的表达水平

2.5 稳定靶向敲低LINC01224对结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响MTS结果显示，与对照组(sh-NC组)相比，靶向干扰LINC01224表达抑制LoVo和SW620细胞增殖(图6A、B)，差异有统计学意义(LoVo：48 h，t=9.21，P<0.01；72 h，t=45.84，P<0.01；96 h，t=47.42，P<0.01；SW620：48 h，t=15.27，P<0.01；72 h，t=10.98，P<0.01；96 h，t=13.21，P<0.01)；流式细胞术结果显示，在LoVo细胞中，sh-NC组细胞凋亡比例为(8.22±0.41)%，低于sh-LINC02114组细胞凋亡率(24.66±0.93)%；在SW620细胞中，sh-NC组细胞凋亡比例为(6.35±0.34)%，低于sh-LINC02114组细胞凋亡率(23.42±0.63)%(图6C、D)，差异有统计学意义(LoVo：t=28.05，P<0.01；SW620：t=41.53，P<0.01)。

图6 下调LINC01224表达抑制结直肠癌细胞增殖、诱导细胞凋亡

3 讨论

lncRNA是控制基因并影响多种生物学进程的重要表观遗传调控因子。lncRNA能够在染色质水平、转录水平和转录后水平等多个层面调控基因表达，作用范围十分广泛[7]。染色质水平的调控是最早被鉴定的lncRNA功能之一。lncRNA可通过直接募集DNA甲基转移酶或其他复合物改变染色质的结构并调节基因的表达水平[8-10]。其次，lncRNA可干扰增强子和启动子的作用进而干扰转录进程，如干扰蛋白质因子结合、调节关键凋亡基因转录等[11]。LncRNA还可以通过识别互补序列，参与信使RNA(mRNA)的转录后修饰，如充当竞争性内源RNA(ceRNA)等[10,12-13]。研究[2-6,14]表明，LINC01224在多种肿瘤的发病机制中起重要作用，可能成为潜在的肿瘤治疗靶点。在肝癌中，LINC01224可通过竞争性结合miR-330-5p上调CHEK1表达，从而促进肝癌发展[2]。在卵巢癌中，LINC01224可作为竞争性RNA通过与miR-485-5p结合，上调PAK4表达，促进癌细胞增殖、侵袭、迁移和移植瘤生长，同时抑制细胞凋亡[3]。在胃癌中，LINC01224可通过靶向吸附miR-193a-5p上调CDK8表达，加速癌细胞的增殖、侵袭、迁移以及肿瘤形成，并抑制细胞凋亡[4]。在口腔癌中，LINC01224可通过靶向调控miR-125b，促进癌细胞增殖并抑制其凋亡[5]。在肾癌中，LINC01224可通过吸附miR-542-3p上调MFN2表达，阻断Ras-Raf1-ERK1/2信号通路，进而抑制癌细胞增殖和迁移[14]。在结直肠癌中，LINC01224可直接结合具有抑癌基因活性的miR-2467并下调miR-2467表达，促进癌细胞增殖、侵袭及移植瘤生长[6]。但LINC01224对结直肠癌细胞凋亡的影响，迄今尚无文献报道。

该研究通过GEPIA2数据库分析显示LINC01224在结直肠癌组织中的表达高于正常结直肠组织，其在10种结直肠癌细胞中也呈表达上调。鉴于此，设计合成3组针对LINC01224的siRNA，随后转染结直肠癌LoVo细胞并进行qPCR检测，由此筛选出最有效的LINC01224干扰片段siRNA-3。鉴于siRNA在细胞内无法进行复制，随细胞的增殖和分裂易被降解及稀释，其介导的基因沉默效应持续时间短；而shRNA是一段具有紧密发夹环结构的RNA序列，在细胞内可被剪切形成siRNA，其所构建的载体可在细胞内进行自主复制及转录，稳定性更强，促使目的基因的沉默作用可维持时间更长[15]。因此，选择shRNA来构建LINC01224的干扰载体。该实验shRNA发夹结构的设计原则：① 克隆到shRNA表达载体中的shRNA 包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔开，组成发夹结构，由pol Ⅲ启动子控制，随后再连接上5～6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子；② 两个互补寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点；③ 在启动子下游的酶切位点下方紧连一个或两个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔确保转录发生；④ 目的序列的第1个碱基为G以确保RNA聚合酶转录，或者紧连正义链的上游为G；⑤ 插入片段中的茎环位置靠近寡核苷酸的中央；⑥ 正义链与反义链序列上不能出现连续3个以上的T。根据以上原则，利用siRNA-3来设计合成针对LINC01224的shRNA。与质粒和其他的病毒载体相比，慢病毒基因转移效率高，可感染非分裂期与分裂期细胞，免疫原性和细胞毒性低，表达产物稳定且持续时间长，为携带目的基因干扰序列的理想载体[16-17]。因此，以慢病毒为载体来携带LINC01224 shRNA。通过重组病毒包装、靶细胞感染、嘌呤霉素处理及有限稀释法筛选，获得了稳定下调LINC01224的单克隆细胞株，qPCR实验结果显示，LoVo和SW620细胞sh-LINC01224组LINC01224表达水平较对照组分别降低80%和81%，荧光显微镜下sh-LINC01224组与对照组(sh-NC组)LoVo和SW620细胞均可稳定表达绿色荧光。MTS实验结果表明，从48 h开始，靶向干扰LINC01224表达可抑制结直肠癌LoVo和SW620细胞增殖。流式细胞术结果显示，稳定下调LINC01224表达也可诱导LoVo和SW620细胞凋亡。

综上所述，该研究通过重组慢病毒包装shRNA、靶细胞感染、嘌呤霉素及有限稀释法筛选细胞等方法，成功建立了稳定靶向干扰LINC01224表达的LoVo和SW620结直肠癌细胞株，并初步探讨了LINC01224对结直肠癌的增殖及凋亡的影响，为后续进一步研究LINC01224在结直肠癌凋亡中的作用机制奠定了基础。