辣椒辣素对糖尿病大鼠模型视网膜血管通透性的影响

刘 扣，高 翔，陈可洋，蒋正轩

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病常见的微血管并发症之一。长期高血糖会引起视网膜血管系统的病理和功能改变，严重危害劳动年龄人的视力[1]。其中，糖尿病黄斑水肿(diabetic macular edema, DME)的发生率随着DR的进展逐渐增加，Ⅳ期时可达70%[2]。DME的发生与糖尿病视网膜血管的通透性异常增高息息相关。研究[3]表明，辣椒辣素可以有效抑制血管通透性增加以及新生血管。张廷 等[4]提出辣椒辣素能通过增强视网膜内源性降钙素基因相关肽的表达，在一定程度上抑制糖尿病大鼠视网膜细胞的凋亡。但辣椒辣素抑制血管通透性增高的特性是否能在视网膜中发挥作用尚不清楚。

该研究采用辣椒辣素干预DR模型大鼠，采集大鼠血清相关因子、视网膜血管造影、免疫荧光等数据，并检测视网膜中辣椒辣素受体蛋白(transient receptor potential vanillic 1, TRPV1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、闭锁蛋白(occludin)浓度进一步探讨其作用的潜在机制，为明确辣椒辣素的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器辣椒辣素(上海Aladdin公司)；血糖仪、血糖试纸(美国罗氏公司)；链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(美国Sigma公司)；兔Anti-TRPV1抗体(英国abcam公司)、兔Anti-VEGF抗体(成都正能生物有限公司)、兔Anti-occludin(美国Novus公司)；伊文思蓝染料(北京索莱宝生物科技有限公司)；凝胶扫描成像系统Fine-do X6显影仪(上海天能科技有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；总胆固醇(total cholesterol, TC)、三酰甘油(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)检测试剂盒(南京建城生物工程研究所)；其余常见试剂和耗材均来自安徽医科大学卫生检验与检疫学系教研室。

1.2 实验动物造模及干预选取8周龄雄性SD大鼠[5]24只，体质量均为200 g左右(购自安徽医科大学实验动物中心)。适应性喂养1周，动物饲养间环境为12 h/12 h的昼夜节律，相对温度为(23 ± 2) ℃，相对湿度为(50 ± 5)%。随机选取6只大鼠作为正常对照组(NC组)，实验期间给予普通饲料喂养；其余18只大鼠作为糖尿病组先给予HFD喂养4周后，给予禁食16 h处理。将禁食后大鼠按 35 mg/kg的剂量腹腔注射配置好的STZ溶液(STZ粉剂溶于1%的枸橼酸溶液配成浓度为0.1 mol/L缓冲液)。注射72 h后测空腹血糖值≥11.1 mmol/L的大鼠确定为糖尿病模型。糖尿病模型大鼠随机分为糖尿病对照组(DM)6只、糖尿病3 mg/kg辣椒辣素处理组(CAP3)6只、糖尿病6 mg/kg辣椒辣素处理组(CAP6)6只。DM组大鼠和CAP3、CAP6组大鼠分别采用DMSO和2种浓度辣椒辣素灌胃干预。每周1次检测大鼠体质量、空腹血糖(禁食8 h)。大鼠饲养笼每天更换2次垫料，保证环境干燥。整个实验周期共8周。

1.3 实验动物干预后取材辣椒辣素灌胃处理8周后取材。实验大鼠安乐死，留取腹主动脉血，生理盐水反复灌洗脏器清除残余全血后摘取双眼眼球，-80 ℃或经组织固定液4 ℃固定保存。大鼠眼球摘取后立刻使用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗干净，在解剖显微镜下经角巩膜缘间平行于赤道方向剪开，仔细去除眼前节和玻璃体，冰上钝性分离视网膜，储存在1.5 ml EP管中，液氮速冻10 min，于-80 ℃保存。该研究经安徽医科大学动物伦理委员会批准，按照安徽医科大学动物实验规范进行。

1.4 血清TC、TG、HDL、LDL浓度检测收集的全血静置分层后，经3 000 r/min、4 ℃离心15 min，取上层血清-20 ℃保存。按TC、TG、HDL、LDL生化检测试剂盒标准检测浓度。

1.5 视网膜伊文思蓝造影固定深度麻醉的大鼠，经颈内静脉缓慢注射0.5 ml 加热至37 ℃的伊文思蓝溶液，见大鼠通体逐渐变为蓝色。循环20 min后将大鼠安乐死，摘取眼球立刻置于PBS中清洗，避光条件下分离视网膜，并展开在载玻片上，晾干、封片。暗室中，倒置荧光显微镜下采图。

1.6 视网膜免疫荧光将4%多聚甲醛固定的眼球清洗、脱水、石蜡包埋等处理后，按5 μm厚度切片并固定于载玻片上。通过脱蜡复水、抗原修复、BSA封闭、荧光抗体孵育、甘油封片等制成免疫荧光切片，置于荧光显微镜下立即观察、采图。

1.7 视网膜TRPV1、VEGF、occludin蛋白水平检测称取30 mg大鼠视网膜组织，经充分裂解匀浆后离心取上清液，BCA法蛋白定量，变性后于-20 ℃保存。经凝胶电泳分离目的蛋白，恒流转膜，脱脂牛奶封闭，一抗(Anti-TRPV1、Anti-VEGF、Anti-occludin)4 ℃孵育12～16 h，二抗室温孵育30～60 min。将承载目的蛋白的纤维素膜均匀滴加显影液，置于显影仪中拍摄保存。显影结果进行灰度扫描，统计分析。

2 结果

2.1 辣椒辣素对大鼠体质量和血糖的影响与NC组相比，DM组大鼠在实验第 1 周开始体质量降低。与DM组大鼠相比，CAP3、CAP6大鼠体质量增加，差异有统计学意义(F=14.83，P<0.01)。CAP3与CAP6处理组间体质量有数值差距，但差异无统计学意义(图1A)。与NC组相比，3组糖尿病大鼠血糖升高(F=123.8,P<0.01)。整个实验周期，DM、CAP3、CAP6组间血糖值差异无统计学意义(图1B)。

图1 大鼠体质量及空腹血糖值

2.2 辣椒辣素对血管通透性的影响DM组大鼠视网膜血管通透性较NC组大鼠升高、渗漏明显，辣椒辣素对视网膜血管通透性有改善作用。伊文思蓝眼底造影显示(标尺：50 μm)，NC组大鼠的视网膜血管走形规则、清晰，无明显的血管渗漏，见图2A；DM组大鼠视网膜血管形态模糊不清，有多处明显强荧光区域，提示血管渗漏显著(白色箭头)，见图2B；CAP3组大鼠视网膜血管可见微小血管形态迂曲，主要血管有较明显的强荧光，但较DM组荧光强度降低，提示血管渗漏减轻，见图2C。CAP6组大鼠视网膜血管走形接近NC组，血管荧光强度较DM组降低，但与CAP3组差异无统计学意义，见图2D。

图2 视网膜组织伊文思蓝血管造影 ×100

2.3 辣椒辣素对糖尿病大鼠血脂的影响分别检测4组大鼠血清中TC、TG、LDL、HDL浓度。与NC组相比，DM组TC浓度升高，CAP3、CAP6处理组渐次降低该数值，差异有统计学意义 (P<0.05)。且CAP6组TC浓度接近NC组正常值。检测大鼠血清中TG浓度，与NC组相比，DM组TG浓度升高，CAP3、CAP6处理组均显示TG浓度降低至正常值，两处理组差异无统计学意义。糖尿病大鼠LDL导致视网膜脂质沉积。与DM组相比，可见CAP3组LDL浓度降低，CAP6组LDL浓度低于NC组，但并非提示不良反应。与NC组相比，其余3组均表现HDL下降，CAP处理组未显示改善作用(表1)。

表1 血清TC、TG、LDL、HDL含量

2.4 辣椒辣素对视网膜TRPV1、VEGF、occludin的影响大鼠视网膜组织免疫荧光(标尺：50 μm)显示，与未接受辣椒辣素处理组(NC、DM)相比，CAP3、CAP6处理组TRPV1具有较高荧光强度，差异有统计学意义(P<0.05)(图3A)；检测视网膜蛋白提示，CAP3、CAP6组大鼠视网膜TRPV1含量较NC、DM组升高(图3B)，结果表明辣椒辣素可促进视网膜中TRPV1的表达。此外经辣椒辣素干预后，与DM组相比，CAP3、CAP6处理组视网膜VEGF蛋白浓度降低，occludin蛋白浓度升高，差异有统计学意义(P<0.05)；其中，CAP6处理组较CAP3处理组视网膜VEGF更接近NC组(图3C、D)。由此可见，辣椒辣素在视网膜组织中参与调节血管通透性关联蛋白VEGF与occludin的表达。

图3 视网膜TRPV1受体分布、occludin、VEGF蛋白水平

3 讨论

DR随着糖尿病发生率的升高已经成为严重的眼科常见病。高血糖可导致组织缺血低氧、氧化应激和炎症反应，造成视网膜内皮细胞损伤、细胞间连接蛋白减少，最终引起DR[6]。血-视网膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)的破坏是DR的特征性病理改变，可引起血管渗透性增加和新生血管形成。

辣椒辣素是TRPV1(又称瞬时受体电位香草酸亚型1)的激动剂，是存在于辣椒果实中的香草酰胺类生物碱。研究[7]表明，辣椒辣素能促进胆固醇在肝脏中分解代谢，改善高脂血症大鼠血清脂质含量，降低TC、TG、LDL浓度，甚至能有效降低高脂血症大鼠体质量。此外，辣椒辣素能够显著抑制外源性VEGF诱导的内皮细胞血管渗漏、血管形成[3]，其机制可能是辣椒辣素通过抑制血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)的酸磷酸化来抑制VEGF诱导的血管通透性增高。该实验中，辣椒辣素处理组体质量较DM组增加，提示辣椒辣素可能缓解糖尿病特征性体质量下降的症状。两种浓度的辣椒辣素均降低糖尿病大鼠血清TC、TG、LDL浓度，但对HDL含量无改善效果，说明辣椒辣素能促进脂质分子在体内的代谢，但不具备协助HDL将脂质转运进入肝脏的能力。

视网膜血管通透性改变是DME的重要病理特征，而BRB的完整性是保证视网膜血管通透性功能正常的必要条件。视网膜血管内皮细胞是在血液循环和神经视网膜间发挥屏障作用的单层细胞[8]，其细胞间的3种连接结构是保证该作用的核心支柱，包括紧密连接(tight junctions, Tjs)、黏附连接(adherens junctions, AJs)及缝隙连接(gap junctions, GJs)，三者共同维持视网膜血管功能稳定[9]。其中，TJs是BRB最重要的连接结构，其完整性是决定BRB功能是否正常的关键因素。occludin是一种跨膜蛋白，是Tjs的重要组成部分，参与维持上皮细胞及内皮细胞间结构的完整性。occludin受多途径调控，其中促炎因子VEGF会抑制其表达[10-11]。实验结果显示，DM组大鼠视网膜VEGF较NC组表达增高，occludin表达下降。经辣椒辣素处理的CAP3、CAP6组糖尿病大鼠视网膜组织VEGF、occludin表达趋势与DM组相反。该结果提示，DM组大鼠视网膜中过表达VEGF可能抑制了occludin的正常生成，导致TJs构成组分不全，进而导致BRB屏障功能受损，血管通透性异常改变。辣椒辣素处理后，大鼠视网膜VEGF表达下降，occludin受抑制减少，表达恢复。该结果与病理数据也相符合。免疫荧光提示，TRPV1受体在视网膜中广泛分布，且辣椒辣素处理后TRPV1受体较未处理组激活增多。造影结果显示，与NC组相比，DM组大鼠视网膜血管有强而多的荧光渗漏区域，表明视网膜血管壁受损，通透性异常增高，造影剂随损伤的血管壁渗漏进入视网膜组织内。CAP3、CAP6处理组较DM组大鼠视网膜血管可见改善，眼底血管未见明显强荧光区，血管走形较为清晰，提示辣椒辣素缓解了糖尿病大鼠视网膜血管渗漏的情况，具有改善视网膜血管通透性的作用。该研究表明，辣椒辣素能激活糖尿病大鼠视网膜组织中的TRPV1受体, 上调因VEGF过表达而受到抑制的occludin，保护TJs构成组分、维持BRB正常功能。