1例Dandy-Walker综合征合并Xq28重复综合征胎儿的遗传学分析*

谭建新，王艳，林颖，冯浩洋，周冉，许争峰

(南京医科大学附属妇产医院&南京市妇幼保健院产前诊断中心，南京210004)

Dandy-Walker综合征(Dandy-Walker syndrome, DWS, OMIM 220200)是一种罕见的胚胎时期的神经系统先天性发育畸形，影像学检查表现为颅后窝的异常，包括小脑蚓部发育不良、第四脑室囊性扩大及小脑延髓池扩张等，其发病率约为1/35 000～1/25 000[1-2]。X染色体长臂2区8带(Xq28)重复综合征(OMIM 300005)是一种罕见的X连锁隐性遗传病，主要临床表现为智力发育迟缓、肌张力低下、语言发育落后、反复呼吸道感染、癫痫、孤独症样表现等。由于Xq28区域包含了导致Rett综合征的致病基因甲基化CpG结合蛋白2基因(Methyl-CpG binding protein 2,MECP2)，因此又被称为MECP2重复综合征[3]。然而，DWS合并Xq28重复综合征的病例国内尚未见文献报道。本研究对1例超声检查提示为DWS和先天性心脏病的胎儿及父母进行分子遗传学分析，以期明确6p25.3p25.1微缺失和Xq28重复为胎儿畸形的遗传学病因，并且证实该6p25.3p25.1微缺失和Xq28重复为新发变异，从而为怀孕夫妇提供明确的遗传学诊断和遗传咨询。

1 研究对象与方法

1.1研究对象 孕妇， 28岁，孕23+周超声提示：“小脑下蚓部见0.70 cm的裂隙，右心室游离壁增厚，室间隔见0.17 cm的回声失落，升主动脉内径0.25 cm，主动脉峡部内径0.16 cm，主肺动脉内径0.48 cm，Dandy-Walker综合征和先天性心脏病可能”来我科进行遗传咨询。否认染色体相关遗传病家族史，否认孕期有毒或有害物质接触史。经遗传咨询和充分知情同意后，家属选择放弃胎儿，行引产术。为进一步明确胎儿先天发育异常的遗传学病因，取胎儿皮肤组织进行染色体微阵列分析，采集父母外周血进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)分析。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取 采用全自动核酸提取仪(厦门芮宝生医股份公司)提取胎儿皮肤基因组DNA并用NanoDrop 2000超微量分光光度计(美国赛默飞世尔科技公司)测定DNA浓度及纯度。

1.2.2单核苷酸多态性微阵列分析(single nucleotide polymorphism array, SNP array) 采用CytoScan 750K芯片(美国Affymetrix公司)进行，该芯片包含55万拷贝数变异(copy nu Mber variations, CNVs)探针和20万单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)探针，平均探针距离约为4 100 bp。按照标准实验流程进行操作，取500 ng DNA进行限制性内切酶消化、连接后进行PCR扩增，对扩增产物纯化、定量分析、片段化后，进行标记并与芯片进行杂交反应和染色，使用GeneChip Scanner 3000 7G扫描仪扫描芯片，采用Chromosome Analysis Suite (ChAS)软件分析拷贝数变化。

1.2.3荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH) 采用XYpter/XYqter和6pter/6qter探针(美国Vysis公司)对胎儿父母的外周血样本进行FISH分析，按照本课题组前期试验步骤操作[4]，其中XYpter和6pter探针为绿色信号，XYqter和6qter探针为红色信号。取2 mL外周血样本进行体外培养，制片后将玻片置于68 ℃烤片20 min，将玻片置于柠檬酸钠缓冲液中浸泡5 min，再依次置于70%、85%、无水乙醇中脱水，待玻片完全自然晾干后，置于预热好的70%甲酰胺中变性2 min，随后依次置于-20 ℃中的70%、80%、无水乙醇中脱水，加入探针，加盖玻片，用封片胶封片，置于37 ℃恒温箱温育过夜。次日，移除盖玻片，立即将玻片浸入75 ℃、含0.3%NP-40的柠檬酸钠缓冲液中，漂洗2 min，再置于含0.1% NP-40的柠檬酸钠缓冲液中，漂洗30 s，取出避光晾干，加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride, DAPI)复染剂至目标区域，立即盖上盖玻片。暗处静置10～20 min后镜检。

1.2.4多重连接依赖探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA) 按照MPLA P095和P070试剂盒(荷兰MRC公司)说明书进行检测，其中P070试剂盒主要用于23对染色体亚端粒区域微缺失微重复的检测，P095试剂盒主要用于21、18、13、X、Y染色体非整倍体的检测。按照荷兰MRC公司提供的标准实验流程进行操作，包括变性、杂交、连接及扩增，扩增产物采用ABI 3500基因分析仪(美国赛默飞世尔科技公司)检测，数据分析采用Coffalyser V8.0软件进行。

2 结果

2.1SNP array检测结果 本研究检测结果显示，胎儿6号染色体p25.3p25.1区段存在约5.4 Mb大小的拷贝数缺失：arr[hg19] 6p25.3p25.1(380,807-5,803,721)×1，该区段缺失可引起“6p末端缺失综合征”，含关键致病基因FOXC1(OMIM 601090)、TUBB2A(615101)和TUBB2B(612850)；X染色体q28区段存在约4.2 Mb大小的拷贝数重复：arr[hg19] Xq28(151,042,968-155,233,098)×2，该区段重复可引起“Xq28重复综合征”，均为致病性的CNVs(图1)。

2.2胎儿MLPA检测结果 采用MLPA试剂盒检测胎儿样本结果显示，位于Xq28区域的L1细胞粘附分子(L1 cell adhesion molecule,L1CAM)基因的探针信号强度升高了约50%(图2A)，而位于6p25.3区域的干扰素调节因子4(interferon regulatory factor 4,IRF4)基因的探针信号强度下降了约50%(图2B)，进一步验证了SNP array的结果。

注:A,6p25.3p25.1区域检出约5.4 Mb缺失； B,Xq28区域检出约4.2 Mb重复。

注:A,Xq28区域L1CAM基因探针信号强度升高；B，6p25.3区域IRF4基因探针信号强度下降。

2.3FISH检测结果 胎儿父母外周血的FISH分析显示未发现相关片段的缺失、重复或易位等异常，提示胎儿致病性的CNVs为新发变异(图3)。

注：胎儿的父(A)母(B)外周血样本目标区域内均未检测到缺失、重复及易位。

3 讨论

在本研究中，笔者通过对超声检查提示为DWS和先天性心脏病的引产胎儿进行SNP array分析，并对其父母进行验证分析，明确了胎儿同时携带6p25.3p25.1缺失和Xq28重复，均为致病性变异。其父母均不携带上述变异，提示胎儿致病性的变异为新发变异。6p25.3p25.1缺失合并Xq28重复国内目前尚未见文献报道。

DWS的病因目前尚不完全清楚，并存在一定的争议。普遍的观点认为是由遗传因素和环境因素共同作用导致的。这些环境因素包括母体糖尿病、酒精、华法林的长期服用、弓形虫感染、病毒(风疹病毒、巨细胞病毒)感染等。遗传因素包括染色体异常，或某些单基因遗传综合征的表型之一，如Joubert综合征、Golden综合征、Meckel-Gruber综合征等[1,5]。研究表明，约有40%的DWS与染色体异常有关，主要包括3号、9号、13号和18号染色体等[6]。本研究中，笔者采用SNP array技术对超声提示DWS综合征和先天性心脏病的胎儿样本进行分析，结果发现该样本同时存在6p25.3p25.1区段5.4 Mb的拷贝数缺失和Xq28区段4.2 Mb的拷贝数重复。其中，6p25.3p25.1区段为6p末端缺失。目前已有学者报道了6p末端缺失导致的综合征，主要临床表型包括小脑蚓部发育不全、眼距宽、小头畸形、进行性感音神经性耳聋、先天性心脏缺陷、精神发育迟缓等[7]。因此，笔者推测本研究发现的胎儿样本6p25.3p25.1缺失可能与其先天性心脏病表型有关。最近，罗玉琴等[8]报道了1例6p25.3p25.1区段4 266 kb缺失的DWS胎儿，该区段包括了FOXC1(OMIM 601090)、TUBB2A(615101)和TUBB2B(612850)等22个OMIM基因。笔者通过检索DECIPHER数据库发现，本例胎儿的6p25.3p25.1(380,807-5,803,721)区段也包含FOXC1(OMIM 601090)、TUBB2A(615101)和TUBB2B(612850)等26个OMIM基因。有学者研究发现，FOXC1基因缺失与小脑、后颅窝畸形相关，包括小脑蚓部发育不全，小脑延髓池扩大和Dandy-Walker畸形等[7]。Aldinger等[9]的研究表明，FOXC1基因敲除小鼠小脑蚓部发育不全并伴有内侧融合和叶状缺损。因此，本例胎儿样本的染色体缺失片段包括FOXC1基因，可推测其与Dandy-Walker畸形的发生有关。

Xq28重复综合征又称为Lubs综合征，于1999年由Peters等[3]首次报道，由X染色体长臂2区8带重复引起，主要临床表型包括中重度智力低下、婴儿期肌张力低下、语言发育落后、反复呼吸道感染等。该综合征男性发病率高于女性，可能与X染色体的随机失活有关。本例胎儿的重复区域arr[hg19] Xq28(151,042,968-155,233,098)包含87个OMIM基因，其中MECP2(OMIM 300005)基因是Xq28重复综合征的主要致病基因。该基因广泛表达于人体的多个组织，在脑组织中的表达尤为丰富[10]。研究表明，在小鼠中过表达MECP2基因导致运动协调障碍、焦虑加剧、学习和记忆障碍，并伴有长期增强和短期突触可塑性障碍[11]。而MECP2基因的突变和缺失会导致Rett综合征[12]。

综上，本研究对1例超声提示DWS和先天性心脏病的引产胎儿进行SNP array分析，证实该胎儿同时携带6p25.3p25.1缺失和Xq28重复，均为致病性变异。对于超声异常的胎儿，采用SNP array进行诊断，可发现临床相关的CNVs，为更准确的遗传咨询提供依据。