唐筛高风险和临界风险孕妇中非21/18三体染色体异常结果分析*

时文丽，袁二凤，田远，高金爽，郭亚清，桑敏，杨丽君，张琳琳

(郑州大学第三附属医院，a.妇产科，b.检验科，郑州 450052)

据统计，我国出生缺陷发生率约为5.6%[1]，其中胎儿染色体异常是导致新生儿出生缺陷疾病的重要原因之一。目前我国针对染色体异常的主要产前筛查手段是唐氏综合征产前筛选检查(唐筛)和无创产前检测技术(noninvasive prenatal test, NIPT)。唐筛是利用母体血清学指标[2]对21/18三体综合征进行风险评估，当胎盘或胎儿结构存在异常时可导致孕妇血清生化指标的改变。NIPT是利用新一代DNA测序技术对母体外周血浆中的游离DNA片段(包含胎儿游离DNA)进行测序，特异性识别被检胎儿是否患21/18/13三体综合征。故而唐筛的特异性和敏感性均不如NIPT。但多项研究证实，唐筛假阳性结果往往与非21/18三体的染色体异常相关[3-5]。随着产前诊断技术的发展，染色体微阵列(chmmosomal microamy analysis，CMA)技术和基于二代测序的低深度全基因组拷贝数变异(CNVseq)检测也逐步应用于临床，二者可以检测1×105bp以上的染色体微缺失/微重复。但该两项技术在产前应用的适应症中均未提及唐筛高风险或临界风险人群[6-7]。本研究通过分析自愿选择CMA或CNVseq技术的人群数据，旨在探讨唐筛对非21/18三体染色体异常的检测出效能，分析致病性或倾向致病性CNVs的检出率，以期为唐筛高风险和临界风险孕妇后续产前诊断的实验室检测方案的选择提供数据支持。

1 资料与方法

1.1研究对象 选择2018年12月至2019年12月因唐筛高风险或临界风险在郑州大学第三附属医院产科门诊就诊且行羊水CMA或CNVseq检测的孕妇3 028例，年龄19～45岁，孕龄17～25周。根据产前筛查中心报告的唐筛风险结果分为高风险组(2 555例)和临界风险组(473例)，其中高风险组为血清学筛查提示21-三体综合征高风险(≥1∶270)和(或)18-三体综合征高风险(≥1∶350)的孕妇；临界风险组为血清学筛查提示21-三体临界风险(1∶270～1∶1 000)和(或)18-三体临界风险(1∶350～1∶1 000)的孕妇。所有病例均为自然受孕、单胎妊娠，进行产前诊断前无胎儿超声异常表现；排除具有染色体异常遗传病史及家族病史、妊娠前患有基础疾病(如高血压、糖尿病、血液疾病、肝肾功能不全及恶性肿瘤)等可能影响母体血清标志物水平因素的孕妇。本研究经郑州大学第三附属医院医学伦理委员会审核批准(批准文号：2021-WZ-007)，孕妇及家属签署知情同意书。

1.2主要仪器与试剂 GE Voluson E8型彩色多普勒超声诊断仪(美国GE公司)，台式高速离心机(美国Thermo Fisher公司)，ABI 9700 PCR System(美国Applied Biosystems公司)，基因组DNA纯化浓缩仪(Genomic DNA Clean&Concentrator，美国Zymo公司)，Affymatrix CytoScan 750K芯片(美国Thermo公司)，Nextseq CN500高通量测序仪(美国Illumina公司)。QIAamp血液DNA纯化试剂盒(德国Qiagen公司)。

1.3方法

1.3.1羊水组织收集 孕妇在完善血常规、血凝、传染病4项(包括艾滋病、乙肝、丙肝和梅毒)、心电图、胎儿常规超声检查后，在产前诊断门诊行B超辅助下羊膜腔穿刺术，无菌抽取羊水8～15 mL，置于4 ℃保存。采集标本时避免血液污染。

1.3.2基因组DNA提取及检测 采用离心法(15 000 r/min离心10 min)收集离心管底白色沉淀，即胎儿的脱落细胞，按照QIAamp血液DNA纯化试剂盒说明书进行细胞DNA抽提。对采用CMA检测的孕妇，采用短串联重复(short tandem repeat，STR)位点比对法进行母血污染的鉴定，确认无母血污染后，按照Affymatrix CytoScan 750K芯片说明书进行CMA检测，包括酶切消化、PCR、标记、杂交芯片扫描等操作。对采用CNVseq检测的孕妇，采用磁珠法提取DNA，将50 ng DNA用于构建DNA文库。使用Nextseq CN500高通量测序仪对全基因组DNA进行测序。

1.3.3数据分析 将上述两种测序方式得到的数据进行序列比对和数据分析，获取全部≥1×105bp的染色体基因组拷贝数变异。将上述染色体基因组拷贝数变异数据分别与人类染色体变异数据库(database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensemble resources，DECIPHER，https://decipher.sanger.ac.uk)、基因变异数据库(database of genomic variants，DGV，http://projiects.tcag.ca/variation)、细胞基因组国际标准数据库(International Standards for Cytogenomic Arrays，ISCA，http://www.iscaconsortium.org/)、GeneReviews数据库(https://www.generreviews.org/)、Clingen数据库(https://dosage.clinicalgenome.org/)和在线人类孟德尔遗传数据库(online Mendelian inheritance in man，OMIM，http://www.omim.org/)中的已有数据进行比对[8]，按照2020年美国医学遗传会与基因组学会(ACMG)标准[9]进行致病性分析，将检出的CNVs分为致病性、倾向致病性、临床意义不明确、倾向良性、良性5个级别，并着重分析致病性或倾向致病性CNVs。

2 结果

2.1唐筛高风险或临界风险孕妇的CMA或CNVseq检测结果 3 028例孕妇中唐筛高风险孕妇2 555例、临界风险473例，二者共检出胎儿致病性或倾向致病性染色体异常107例，占3.53%(107/3 028)，其中21/18三体综合征55例，占1.82%(55/3 028),性染色体异常7例，占0.23%(7/3 028)，致病性或倾向致病性CNVs 44例，占1.45%(44/3 028)。结果见表1。

表1 3 028例孕妇中各种致病性或倾向致病性染色体异常的检出情况及比较[n(%)]

2.2唐筛高风险或临界风险孕妇中CNVs的检出情况 唐筛高风险或临界风险孕妇经CMA或CNVseq检测验证后提示存在CNVs 106例，按照ACMG标准分级，分为致病性CNVs 28例，倾向致病性CNVs 16例。见表2。

表2 CNVs致病性情况分析[n(%)]

按照ACMG标准对CNVs的评级,在28例致病性CNVs中明确综合征疾病22例，其中1个病例含2个致病性综合征。包括类固醇硫酸酯酶缺乏症(STS)9例、Xq28微重复综合征2例、Digeorge综合征2例、16p11.2微重复综合征2例、16p11.2微缺失综合征、17q21.3微缺失综合征、16p13.11微缺失综合征、22q11.2微重复综合征、PWS/AS综合征、2q37微缺失综合征、1q21.1微缺失综合征、Xp11.23微缺失综合征各1例。

2.3唐筛高风险组和临界风险组提示染色体异常检出率的比较 高风险组和临界风险组对21/18三体、致病性或倾向致病性非21/18三体染色体异常和CNVs的检出率结果见表1。分别对两组进行卡方检验，发现唐筛高风险组对21/18三体的检出率明显高于临界风险组，差异具有统计学意义(χ2=4.392，P=0.036)；但对致病性或倾向致病性非21/18三体的染色体异常的检出率差异无统计学意义(χ2=0.114，P=0.735)；对致病性或倾向致病性CNVs的检出率差异无统计学意义(χ2=0.003，P=0.958)。

2.421/18三体综合征与致病性或倾向致病性的CNVs检出率的比较 纳入研究的所有孕妇中胎儿致病性或倾向致病性CNVs的检出率为1.45%(44/3 028)；胎儿21/18三体综合征的检出率为1.82%(55/3 028)。唐氏筛查对21/18三体综合征的检出率与致病性或倾向致病性CNVs的检出率差异无统计学意义(χ2=1.243，P=0.265)。

3 讨论

染色体异常是新生儿出生缺陷的重要原因之一，目前唐筛对21/18三体综合征的产前筛查价值已得到广泛认可，本研究重点分析唐筛结果阳性孕妇中非21/18三体染色体异常情况。目前产前诊断的方法众多，其中CMA[10]和CNVseq[11-12]检测技术是对全基因组进行覆盖检测，可发现传统染色体核型分析不能检测的染色体微缺失/微重复，且自动化程度高，结果判断相对客观。有研究报道，CMA或CNVseq检测染色体非整倍体及CNVs的敏感性及特异性均为100%[13]。因此，本研究应用CMA和CNVseq检测技术对唐筛高风险或临界风险孕妇羊水进行验证。

唐筛作为一种广泛应用但特异性不高的产前筛查手段，对于非21/18三体染色体异常也有一定的提示作用。2018年，Lindquist等[14]通过对澳大利亚墨尔本地区2014和2015年行产前检测的孕妇进行回顾性分析，结果发现在传统孕早期血清学筛查结果为高风险的人群中，可以检出大量21/18/13三体综合征之外的其他染色体异常。2018年，Vogel等[4]在丹麦地区发现孕早期筛查对致病性CNVs具有一定的检出作用。本研究对唐筛高风险和临界风险孕妇中染色体异常结果分析显示致病性或倾向致病性CNVs的检出率达1.45%，而人群中CNVs总体发病率为0.37%(1/270)，远高于人群中染色体异常的发生率，说明当唐筛存在高风险或临界风险时，应考虑到非21/18三体染色体异常，特别是CNVs的可能性。本研究进一步对检出的致病性CNVs进行分析，发现该类患者多伴有智力低下、精神异常、发育迟缓、多器官畸形等症状，但本研究中检出率最高的类固醇硫酸酯酶缺乏症(STS)主要表现为皮肤鱼鳞样改变，致死致畸率低，这可能是人群中高发的原因之一，在遗传咨询时要告知患者可能存在的相关风险。本研究结果提示高风险和临界风险人群中21/18三体综合征与致病性或倾向致病性CNVs的检出率基本一致，但目前针对唐筛存在风险孕妇行进一步产前诊断多采用染色体核型分析，因此，存在漏诊致病性或倾向致病性CNVs的情况。故而建议后续进行产前诊断时应纳入CMA或CNVseq检测技术，避免染色体异常出生缺陷儿的出生。

然而，CMA或CNVseq在检出致病性或倾向致病性CNVs的同时，也检出了部分目前临床意义不明确的CNVs，这给遗传咨询时对其的解读带来了挑战和困难，同时也给孕妇及家属造成困扰。Miller等[15]研究发现，约12%找不到具体原因的先天畸形胎儿是由染色体微缺失微重复导致的。因此，随着检测水平的不断提高，在大量数据研究论证下那些临床意义不明确CNVs可能是致病性的，这也将成为未来研究的热点。