外泌体分子标志物检验技术进展及临床应用*

王君怡，李荣，许文荣，江佳佳

(1.江苏大学附属澳洋医院澳洋肿瘤研究院，江苏张家港215600；2.江苏大学医学院，江苏镇江212013)

外泌体是由细胞内多囊泡体通过膜内陷包裹内容物并与细胞膜融合后被释放到胞外的一类微小囊泡[1]，在血液、尿液、脑脊液、唾液、母乳、羊水、淋巴液和胆汁等多种体液中均可检出外泌体[2]。外泌体包裹蛋白质、脂质、核酸及代谢物等生物活性物质，参与机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等过程[1]。近年来，外泌体高通量组学筛选与分析检测技术已取得明显进展，外泌体分子标志物的检验及应用实现新的突破。为此，本文将讨论不同来源的外泌体分子标志物的检测方法及其应用价值。

1 外泌体提取

1.1体液样本采集与预处理 血液外泌体提取通常采用血清或血浆样本。血清样本用于外泌体微小RNA检测，EDTA抗凝血浆常用于外泌体RNA分析。EDTA抗凝血室温以2 500×g离心15 min去除血小板，收集上层血浆再次离心后即可获得。

尿液具有无创、简便、量大等优势，尿液外泌体miR-142-3p、miR-142-5p、miR-223-3p和前列腺特异抗原组合可显著提高前列腺癌诊断效率[3]。尿液收集后通常需加入蛋白酶抑制剂以防外泌体表面蛋白分子降解，再以4 ℃、3 000×g离心15 min即可。

脑脊液外泌体miRNA-9-5p和miRNA-598可作为阿尔兹海默症的潜在生物标志物[4]。腰椎穿刺或术中采集脑脊液时应避免穿刺损伤带来的血液污染。所获样本以4 ℃、3 000×g离心15 min。

唾液外泌体GOLM1-NAA35嵌合RNA可作为食管鳞状细胞癌的早期诊断标志物[5]。唾液具有非侵袭性、易收集、依从性高等优势。但唾液黏性高，样本应进行超声或过滤，再以4 ℃、3 000×g离心20 min去除杂质。

为保证外泌体的纯度和生物活性，脑脊液、血液样本应在采集后1 h内，尿液和唾液样本则在采集后2 h内进行预处理。若长期储存，应分装冻存于-80 ℃，避免反复冻融。

1.2外泌体分离与纯化 外泌体有效分离是外泌体分子标志物检测的关键。依据其物理、化学和生物学特性已建立了多种分离方法,各有利弊，应根据样本来源、检测目的与预算成本等实际情况进行选择(表1)。

表1 常用外泌体分离技术

超速离心法是基于外泌体尺寸差异采用不同相对离心力提取外泌体的经典方法[6]。该法技术成熟但耗时长，适用于大体积样本。

密度梯度离心法是依据样本中不同组分的沉降系数分离外泌体，按照介质可分为蔗糖密度梯度离心法和碘克沙醇密度梯度离心法[6]。

超滤法利用超滤膜孔径大小对不同分子质量的物质进行分离，通常选用相对分子截留量为100 kDa的超滤管，提取外泌体的同时能够浓缩样本量[6]，可有效减少因超高速离心对外泌体的损坏。

聚合物沉淀法是利用聚合物作为沉淀剂从样本中分离沉降出外泌体，其中聚乙二醇(PEG)是最常用的沉淀试剂。样本在4 ℃经PEG处理后过滤或离心即可沉淀、回收外泌体，但夹杂的大量脂蛋白和RNA可能影响后续分析。现已基于该方法开发出众多商品化外泌体提取试剂盒。

免疫磁珠法利用包裹单克隆抗体的磁珠捕获外泌体表面特异性分子进行外泌体提取，可确保外泌体的特异性和完整性并能进一步分离不同外泌体亚群，但其只能提取高表达靶抗体的外泌体[6]。

尺寸排阻色谱法以不同粒径的聚合物凝胶填料作为分离介质，基于尺寸差异分离外泌体。操作时需考虑凝胶颗粒的孔径、外泌体与介质间的相互作用、混合液中各物质分子量差异等因素以提高分离效率[7]。

微流控技术是基于微流控芯片实现各种微粒分离与检测的新技术，又被称为“芯片实验室”。近年来，研究者在微流控技术的基础上结合纳米声学过滤器、粘弹性流体分选、侧向位移和免疫亲和等技术[8]开发出多种低成本、高效率、高通量的新型外泌体分离方法。Wang等[9]将声学和微流体技术融合，使用微小的声流芯片分析唾液样本，5 min内实现对唾液外泌体的自动分离。Xu等[8]建立了一种集分离、富集和检测为一体的肝癌相关外泌体分析平台，该芯片由1个Y型微柱阵列组成的捕获区和级联的ITO电极构成，将特异性磷脂酰丝氨酸Tim4蛋白识别的磁富集技术与信号转导技术结合，仅需4 h即可从30 μL血液样本中分离出肝癌来源外泌体，并进行后续分析。

场流分离是在垂直于样品流的上方施加流体场，以便基于样品尺寸、质量、密度、体积等理化性质进行物质分离[10]。目前应用最广泛的场流分离技术是非对称流场流分离。样本在交叉流力场和扩散力的双重作用下，根据流体动力学的尺寸差异分布于交叉流截面不同高度，随后在纵向流载液的推动下分离外泌体，并能进一步鉴定外泌体亚群[10]。该法可从小鼠黑色素瘤细胞系成功分离出外泌体，并可联用紫外检测器、多角度激光散射检测器等技术进行分析与表征[11]。

1.3外泌体鉴定 外泌体鉴定主要包括形态、大小和表面标记蛋白质。通过扫描电镜和透射电镜等可直接观察外泌体形态与结构，典型形态呈酒杯状。纳米颗粒跟踪分析和动态光散射计算获得外泌体粒径与浓度，多集中于30～150 nm。western blot检测CD63、CD9、CD81、TSG101、HSP70、ALIX等外泌体标志蛋白质。此外，流式细胞仪可通过特异性标记抗体或特殊染料快速、高通量地筛选和分析外泌体。

2 外泌体分子标志物分析技术与临床应用

外泌体携带大量特异性蛋白质、脂质、核酸和代谢物等，它们与多种疾病的发生、发展密切相关，分析外泌体中特异性分子的表达水平对疾病诊疗有重要意义。

2.1蛋白质类标志物 外泌体蛋白质水平的分析技术主要有蛋白免疫印迹、ELISA、纳米流式细胞术、免疫电镜、串联质谱法等，其中免疫印迹法和ELISA最为常用，但许多低丰度的蛋白质无法检出。质谱分析逐渐成为外泌体蛋白质组学检测的重要技术。Xie等[12]利用TMT蛋白质组学技术筛选并验证，结果发现血清外泌体ITGβ3的表达水平与骨密度成正相关(r=0.304,P=0.009)，有助于老年骨质疏松症的诊断和治疗。Hoshino等[13]使用液相色谱-串联质谱法对源于16种不同肿瘤的120份血浆外泌体样品进行蛋白质组学分析，筛选出相关蛋白质组合应用于疾病诊断和肿瘤类型预测，对原发性未知肿瘤的分类可达到95%敏感性和90%特异性。以上研究表明外泌体蛋白可作为疾病诊断及预后的潜在生物标志物。

2.2脂质类标志物 外泌体脂质检测方法以质谱分析为主。Skotland等[14]采用高通量质谱定量分析方法发现前列腺癌患者尿液外泌体中有9种脂质的表达水平显著升高，其中磷脂酰丝氨酸和乳糖基神经酰胺检测的敏感性为93%，特异性为100%。最近，有学者利用靶向-非靶向串联质谱评估发现，COVID-19患者血浆外泌体中单唾液酸二己糖神经节苷脂含量与COVID-19的严重程度呈显著正相关(P=0.003 7)，有望成为COVID-19新型检测指标[15]。

2.3代谢物标志物 外泌体中小分子代谢物逐渐被关注。研究者通过靶向超高效液相色谱-串联质谱技术发现尿液外泌体中葡萄糖醛酸、D-核糖-5-磷酸和异丁酰基-L-肉碱等代谢指标对前列腺癌的诊断及预后具有一定指导作用[16]。Luo等[17]研发了一种携带电喷雾离子源的纳流液相色谱-质谱分析平台，可定量检测和分析血浆外泌体中的痕量代谢物。

2.4核酸类标志物 外泌体标志物研究主要集中于非编码RNA，相关技术包括高通量的基因芯片和二代测序技术，可实现外泌体非编码RNA表达谱分析，大力推动了低丰度LncRNA和circRNA的研究。

2.4.1qRT-PCR技术 该技术广泛应用于外泌体RNA的检测。Sun等[18]结合exoRBase数据库和qRT-RCR技术发现联合检测hsa_circ_0004001、hsa_circ_0004123和hsa_circ_0075792可明显提高原发性肝癌的诊断敏感性(90.5%)和特异性(78.1%)。Ji等[19]采用qRT-PCR技术筛选出的血清外泌体miR-374a-5p可作为高灵敏度、高稳定性的早期胃癌诊断标志物，ROC曲线下面积为0.919。

2.4.2数字PCR 该技术是一种核酸分子绝对定量技术，无需标准曲线，对LncRNA和circRNA也能实现高精度的靶标定量[20]，有效弥补qRT-PCR技术灵敏度不够、步骤繁琐及假阳性率高等问题(表2)。Hu等[21]采用液滴数字PCR技术发现联合分析circGSK3β和癌胚抗原可显著提高食管鳞状细胞癌早期诊断敏感性(87.5%)。Bai等[20]开发了一种多色荧光数字PCR EV-LncRNA，可简单、快速、高通量分析肺癌血液外泌体LncRNA的表达。另外，Yoshizawa等[22]使用3D数字PCR技术发现早期胰腺导管腺癌患者尿液外泌体中miR-3940-5p/miR-8069比值显著升高，与CA19-9联合检测时其敏感性和阳性预测值分别提高至93%和78.4%。

表2 核酸分子分析新技术

2.4.3目前正在逐步开发应用更灵敏的自动化外泌体核酸分析技术 He等[23]基于全内反射荧光成像原理开发了一种单囊泡成像分析方法，该法将分裂式DNA酶和荧光淬灭底物共同包装至外泌体，产生靶向miRNA的催化裂解反应和放大的荧光信号，从而直接观察血清外泌体并对其包裹的miRNA进行原位定量和分析。Wu等[24]根据表面等离子体共振成像(SPRi)原理设计出一种新型生物传感器，通过Au-on-Ag异质结构和新型DNA纳米材料之间的协同作用超灵敏地检测出非小细胞肺癌相关外泌体miRNA，可用于早期诊断。Yang等[25]将等离子体共振瑞利散射光谱法和暗场显微镜融合，开发了一款新型集成微流控装置，能从非小细胞肺癌患者尿液中分离并检测相关外泌体，发现早期肺癌患者。

3 外泌体分子标志物常用生物信息学技术

随着高通量检测手段的发展和外泌体分子标志物研究的深入，现已建立多种外泌体相关数据库以供查阅(表3)。

表3 外泌体分子标志物常用数据库

exoRBase数据库是目前最为齐全的外泌体内容物数据库，囊括了92个血样RNA-seq实验数据，覆盖多种疾病，主要为血液外泌体中的circRNA、LncRNA和mRNA。

EVpedia数据库收集了原核生物、非哺乳类真核生物和哺乳动物囊泡的高通量分析数据，并提供相关分析工具，操作方便、实用性强。

ExoCarta数据库是首个外泌体标志物综合数据库，覆盖多物种、多组织器官外泌体内容物数据，并附加外泌体蛋白互作网络和相关生物学信息以供检索。

此外，还有Vesiclepedia数据库、EVmiRNA数据库、EVLncRNA2.0数据库、外泌体circRNA数据库、Urinary Exosome Protein Database数据库、exRNA Atlas数据库、miRandola数据库等，可根据实际需求联合使用。

4 小结及展望

体液中外泌体体积小、分布广、含量高，其脂质膜结构能有效保护内容物不受体液中各种酶类干扰[26]，几乎所有类型的细胞均能分泌外泌体，因此，外泌体标志物的检测为慢性病和恶性疾病的早期诊断和精准治疗带来新的希望。近年来涌现出多种新型外泌体分离方法如微流控技术和非对称流场流分离技术，可实现外泌体高效率、高纯度的富集。基于生物传感器、质谱分析、SPRi和数字PCR等新型检测技术也被逐渐应用。然而现阶段外泌体分子标志物检测应用仍受到一些限制，例如大量的临床数据如生存时间、预后状况、病理相关性分析不够完备；缺乏足够的临床样本支撑和严格的方法学评价；缺少足够灵敏且快速的检测方法，外泌体分子标志物一体化检测平台有待开发。

外泌体分子标志物的研究也推动了外泌体靶向治疗的发展，天然或工程化修饰的外泌体被视为恶性疾病精准治疗的一种理想工具。例如外泌体作为靶向Kras G12D的给药载体可明显缓解小鼠胰腺癌的进程[27]；具有靶向修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIONs)的外泌体是2型糖尿病治疗的潜在药物载体[28]。因此，鉴于外泌体分子标志物检测方法的不断完善，其临床应用会显示出在疾病预防、诊疗及康养中的重要价值。