敲除巨噬细胞对胆管结扎小鼠胆汁淤积的干预作用

田心蓓 陈珊珊 王伟鹏 吴 博 朱 景 周 莹 肖永陶

上海交通大学医学院附属新华医院 上海市儿科医学研究所 上海市小儿消化与营养 重点实验室（上海 200092）

胆道闭锁（biliary atresia，BA）是发生在婴幼儿时期的一种胆汁淤积性肝病，主要表现为肝内外胆管闭锁及持续性黄疸[1-2]。肝门空肠吻合术（Kasai术）是临床治疗BA 的首选方案，但术后持续性胆汁淤积及进行性肝损伤和纤维化，极大地制约了手术效果，使得BA 成为儿童肝移植最常见原因，占全部儿童肝移植的40%～50%[3]。因此，减轻肝内胆汁淤积成为BA临床干预的重要手段。

研究报道，巨噬细胞在BA肝损害中起重要作用，但作用机制仍不明确[4]。胆管结扎是模拟BA 肝外胆管闭锁的重要模型[5]。利用小鼠对白喉毒素（diphtheria toxin，DT）不敏感这一特点，通过将人类白喉毒素受体（diphtheria toxin receptor，DTR）基因转入小鼠CD 11 B 启动子后可以特异性敲除小鼠体内巨噬细 胞[6]。本研究将利用转基因小鼠（CD11b-DTR）及胆管结扎（bile duct ligation，BDL）小鼠模型研究巨噬细胞对BA胆汁酸代谢紊乱的作用机制，为临床干预BA疾病进程提供新的思路和靶点。

1 材料与方法

1.1 动物模型与分组

7 周龄CD 11 b-DTR 小鼠接受BDL 或假手术，术后饲养于清洁环境中。将小鼠随机分为假手术组（Sham）、假手术干预组（DT）、胆管结扎组（BDL）及胆管结扎干预组（BDL+DT），Sham 组、DT 组各6 只小鼠，BDL、BDL+DT 组各8 只小鼠。术后DT 组和BDL+DT 组每隔2 天腹腔注射1 剂DT（剂量：25 ng/g小鼠体质量）以敲除小鼠体内巨噬细胞，Sham组和BDL 组每隔2 天腹腔注射生理盐水作为对照，小鼠存活2周后在最后1剂注射24小时后颈椎脱臼处死小鼠，使用灭菌手术器械分离出小鼠肝脏和结肠，将肝脏放入无菌冻存管后冷冻于-80 ℃冰箱；用无菌刮勺刮出结肠内容物后存放于无菌离心管中。

本实验所涉及小鼠均来自南京大学-南京生物医学研究所。实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2018-0008，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2018-0027。所有实验方案均经上海交通大学医学院附属新华医院医学伦理委员会批准（XHEC-F-2020-009）。

1.2 方法

1.2.1 16S rRNA基因的定量PCR扩增 用Qiagen 公司的QIAamp Fast DNA Mini Kit 试剂盒从结肠内容物中提取细菌DNA，稀释成浓度为10 ng/mL。采用SYBR Green Universal Master Mix 试剂盒在ABIViiA 7 仪器上进行定量PCR。引物如下，总细菌：5’-CGGTGAATACGTTCCCGG-3’和5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’；Com-SFB：5’-AGGAGGAGTCTGCGGCACATTAGC-3’和 5’-CGCATCCTTTACGCCCAGTTATTC-3 ；Mus-SFB：5’-TGAGCGGAGATATATGGAGC-3’和5’-CATGCAACTATATAGCTATATGCGG-3’；Escherichia：5’-GAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCAT TG-3’和5’-GAGACTCAAGCTKRCCAGTATCAG-3’；Staphylococcus：5’-TTTGGGCTACACACGTGC-TACAATGGACAA-3’和5’-AACAACTTTATGGGATTTGCTGA-3’；Prevotella：5’-CACRGTAAACGATGGATGCC-3’和5’-GGTCGGGTTGCAGACC-3’。结果以目的菌量与总细菌量的比值表示。

1.2.2 16SrRNA 基因扩增子测序 将提取出的结肠内容物菌群DNA采用正向引物515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和反向引物907 R（5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’）对细菌16 S rRNA 基因V 4～V 5 区进行PCR 扩增。PCR 扩增产物用Beckman Coulter 公司的Agecourt AMPure珠纯化，并使用Invitrogen公司PicoGreen dsDNA检测试剂盒进行定量。个体定量步骤结束后，合并等量的扩增产物，利用Illlumina MiSeq平台和MiSeq Reagent Kit v3 在上海派森诺生物技术有限公司进行双末端2×300 bp测序。

1.2.3 胆汁酸谱测定 在上海派森诺生物技术有限公司采用Waters ACQUITY超高效液相色谱（BEH C18 1.7 μm 2.1×100 mm柱）结合Waters Xevo TQ-S 三重四极杆质谱法检测结肠内容物和肝脏中的胆汁酸。采用MassLynx 4.1软件（Waters）进行数据采集和胆汁酸定量。使用胆酸-D4氘代内标（LCA-D4）和胆酸-2,2,4,4-d4（CA-D4）和鹅去氧胆酸24-酰基-β-d-葡萄糖苷（CDCA-24G）作为标准品[7]。

1.2.4 蛋白定量测定 采用Western-Blot方法。各组肝脏组织裂解后提取蛋白，每个泳道分别加入蛋白 30 μg，采用 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用封闭液封闭 1 h，加入胆固醇7α-羟化酶（cyp7a1）一抗（1:1000）4 ℃过夜。使用含0.1%吐温20的Tris-HCL缓冲盐溶液充分洗涤后，加入二抗（1:2000）室温孵育 1 h。用增强化学发光液（ECL）测定蛋白-抗体复合物的含量。在凝胶成像系统中成像，运用 Image Lab 分析软件对各条带进行灰度统计后计算与cyp7a1蛋白与内参蛋白（β-actin）的相对表达量。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0进行数据处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Bonferroni法检验；非正态分布计量资料以四分位数范围表示，组间比较采用秩和检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胆汁酸谱分析结果

Sham组、Sham+DT组、BDL组与BDL+DT组之间小鼠肝脏的总胆汁酸、结合与非结合初级胆汁酸、结合与非结合次级胆汁酸的含量差异均有统计学意义（P<0.01）。与Sham 组相比，BDL 组肝脏中结合与非结合初级胆汁酸及总胆汁酸含量均显著增加，BDL+DT 组肝脏中非结合初级胆汁酸及总胆汁酸含量则较BDL 组明显减少，差异均有统计学意义（P均<0.05）。见表1。Western-Blot结果显示，BDL+DT组小鼠肝脏中胆汁酸合成酶cyp7a1蛋白相对表达量为0.93±0.18，BDL组为1.47±0.10，差异有统计学意义（t=4.70，P=0.009）。见图1。

表1 各组小鼠肝脏组织胆汁酸分析结果（nmol·mg-1）

图1 各组小鼠肝脏cyp7a1 蛋白表达量

Sham 组、Sham+DT 组、BDL 组与BDL+DT 组之间小鼠结肠内容物中的总胆汁酸、结合与非结合初级胆汁酸、结合与非结合次级胆汁酸的含量差异均有统计学意义（P<0.01）。与Sham+DT 组相比，BDL+DT 组小鼠肠内容物中初级胆汁酸及总胆汁酸含量均显著降低，BDL+DT组较BDL组结合结合初级胆汁酸含量降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 各组小鼠肠内容物组织胆汁酸分析结果[M（P25～P75），nmol·mg-1]

2.2 肠道菌群16S rRNA测序结果

16 S rRNA 测序显示各组小鼠结肠菌群在属的水平上存在差异。与Sham 组相比，BDL 小鼠肠道菌Blautia、Streptococcus、Christensenella和Aggregatibacter相对丰度增加，BDL+DT 组小鼠肠道菌Odoribacter、Lactococcus、Bacteroides和Shigella较BDL组的相对丰度增加。见图2。

图2 胆管结扎与选择性敲除巨噬细胞后肠道菌群属水平组成分析

2.3 肠道菌群qRT-PCR分析结果

qRT-PCR 结果显示，Sham 组、Sham+DT 组、BDL 组与BDL+DT 组之间小鼠肠道菌Prevotella属、Escherichia属、Clostridium属、Segmented filamentous bacteria（SFB）属相对丰度的差异均有统计学意义（F=3.63～36.65，P<0.05）。经两两比较发现，BDL组小鼠肠道菌Prevotella属相对丰度（4.21±2.43）高于Sham组（1.00±0.53），BDL+DT组小鼠Escherichia属相对丰度（0.26±0.09）高于BDL组（0.07±0.06），BDL+DT组小鼠Clostridium属相对丰度（0.57±0.20）高于BDL组（0.07±0.05），BDL+DT组小鼠SFB属相对丰度（1.35±0.15）高于BDL组（0.33±0.19），差异均有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

本研究通过聚焦胆管结扎小鼠胆汁酸代谢情况及肠道菌群的变化发现，巨噬细胞能抑制胆汁酸合成，改善胆汁淤积。研究进一步提示巨噬细胞可能通过改变肠道菌群结构发挥调节胆汁酸代谢的作用。

胆汁酸作为胆固醇代谢的主要产物之一，在生理条件下其稳态受到精密的调控[8]。尽管存在多种适应性调节机制，然而在胆道闭锁及胆汁淤积性动物模型中，肝内胆汁酸水平仍有明显增高。在胆汁淤积的肝脏中，胆汁酸积累可诱发肝脏炎症及肝细胞损伤。胆管结扎术模拟了BA 肝外胆管闭锁型，会导致胆汁酸在肝脏中异常积累。研究发现毒性胆汁酸对肝实质细胞造成损伤时往往引起巨噬细胞激活[9]。肝脏巨噬细胞激活后能发挥调节炎症细胞、组织清创及细胞杀伤等作用[10]。前期研究发现巨噬细胞在BA患儿肝内表达升高[11]，提示其在BA进展及修复过程中发挥重要作用。本研究选择性敲除巨噬细胞明显减缓了BDL诱导的胆汁酸淤积。

作为肠道微生态的重要组成部分，肠道菌群与宿主相互作用，对宿主健康有极大影响[12]。近期已有研究将肠道菌群失调与慢性肝损伤的发展联系起来，并证明革兰阴性菌移位可增强肝损害[13]，但仍缺乏关于BA 与肠道菌群之间的关联研究。有研究发现在肝纤维化患者中体内肠道菌群转移和肝损害几乎同时开始[14]。本研究发现，与BDL 小鼠相比，BDL+DT 小鼠肠道菌群Odoribacter、Lactococcus、Bacteroides、Escherichia、Clostridium、Shigella和SFB 在属水平相对丰度增加。据报道，Lactobacilli、Bifidobacteria、Clostridium和Bacteroides可以使胆汁酸与胆盐水解酶（BSHs）发生结合。Clostridium和Eubacterium可以将伯胆汁酸转化为仲胆汁酸[15]。Bacteroides、Eubacterium、Clostridium、Escherichia、Eggerthella、Eubacterium和Ruminococcus均可产生使胆汁酸差向异构化的酶，从而降低胆汁酸的疏水性和毒性[16]。本研究发现选择性敲除巨噬细胞改善了胆汁酸代谢紊乱，其特征是通过降低cyp 7 a 1 表达，降低肝脏中初级胆汁酸合成。此外，近期研究表明肠道细菌可能与宿主胆汁酸结合，产生苯丙胆酸、酪胆酸和白胆酸，从而影响炎症性疾病[17]。这表明巨噬细胞可能通过改变肠道微生物组成和胆汁酸代谢来介导肝脏炎症及肝损伤。据报道SFB 是小肠Th 17 细胞最有效的诱导剂之一[18]。本研究发现，敲除巨噬细胞增加了SFB 相对丰度，并诱导了Th 17 标记物Saa 1-3 在远端小肠的表达，提示巨噬细胞通过影响SFB 的相对丰度参与了BDL 小鼠肠道 炎症。

综上所述，体内选择性敲除巨噬细胞通过调控肠道细菌结构干预肝内胆汁淤积。这一研究结果有助于为胆道闭锁胆汁酸淤积临床干预提供新的手段和 策略。