关节止痛膏控制菌微生物限度检查方法的建立

李亚东，张红霞

1.联勤保障部队第九四〇医院临夏诊疗区，甘肃 临夏 731100；2.解放军西宁联勤保障中心药品仪器监督检验站，甘肃 兰州 730050

关节止痛膏处方来源于1991 年《中药成方制剂标准》，作为一种局部外用橡胶膏，是目前治疗相关病症的常用药物［1-7］。其主要成分包括辣椒流浸膏、颠煎流浸膏、薄荷素油、水杨酸甲酯、樟脑以及盐酸苯海拉明［8］，所用基质包括橡胶、氧化锌、松香、凡士林、羊毛脂等［9-10］。关节止痛膏具有活血散瘀，温经镇痛的功效，在临床上主要用于寒湿瘀阻经络所致的风湿关节痛及关节扭伤［11-12］。

《中国药典》2015 年版四部非无菌产品微生物限度检查法［13］，对计数培养基、微生物限度用培养基、培养温度、培养时间、方法适用性检查等各方面都进行了调整，《中国药典》2010 年版控制菌检查中使用的增菌培养基营养肉汤、胆盐乳糖培养基均被胰酪大豆胨琼脂培养基替代，为了确认所采用的新培养基适合于关节止痛膏的控制菌的检查，本研究对其检查方法进行了方法适用性试验［14］。作为传统中药制剂，关节止痛膏目前在国内共有48个批准文号［15］，涉及的生产企业多达30 多家，本研究收集了6 家生产企业共17 个批号的样品进行试验，以期对其控制菌的检查方法进行统一，确认此方法适合关节止痛膏中控制菌的测定，并确保该方法的有效性和试验结果的科学性［16］。

按照《中国药典》2015 年版四部通则1106 的规定，关节止痛膏每10 cm2不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ME4002E/02 电子分析天平［梅特勒-托利多（上海）有限公司］；LDZX-60KBS 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；UPS 医疗纯水机（成都优普净化科技有限公司）；JJNYI 霉菌培养箱（上海虹浦仪器厂）；HW-B-2 培养干燥箱（厦门医疗仪器厂）；PYX-DH 电热恒温培养箱（国光医疗器械厂）；H.H.S 电热恒温水浴锅（江苏医疗器械厂）。

1.2 培养基和稀释剂

pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：20160426）、甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号：20160113）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号：20170619）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：20160328）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号：20160204）、胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：20160505）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：20160407）均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.3 菌种

试验菌种包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］，上述两种菌种均为第3 代，均由甘肃省食品药品检定研究院提供。

1.4 样品

本试验所用的样品信息见表1。

表1 关节止痛膏来源信息

2 试验方法与结果

2.1 菌液制备

将铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌接种至胰酪大豆胨液体培养基中，33 ℃培养24 h，取上述两种菌的培养物，用pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1 mL 含菌数小于100 cfu 的菌悬液。

2.2 控制菌检查用培养基适用性检查

2.2.1 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基检查用涂布法分别接种不大于100 cfu 的铜绿假单胞菌于被检培养基和对照培养基中，35 ℃培养24 h。结果显示，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征一致，说明被检培养基的促生长能力符合规定；涂布不少于100 cfu 的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基中，35 ℃培养72 h，结果显示，两种培养基上均未有菌生长，说明被检培养基的抑制能力符合规定。

2.2.2 甘露醇氯化钠琼脂培养基检查用涂布法分别接种不大于100 cfu 的金黄色葡萄球菌于被检培养基和对照培养基中，35 ℃培养24 h，结果显示，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征一致，说明被检培养基的促生长能力和指示特性符合规定；涂布不少于100 cfu 的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基中，35 ℃培养72 h，结果显示，两种培养基上均未有菌生长，说明被检培养基的抑制能力符合规定。

2.3 供试液的制备

取供试品2 贴，去掉贴膏剂的保护层，放置在无菌操作台上，粘贴面朝上，用无菌纱布覆盖粘贴面，剪碎，将碎片置于含10%聚山梨酯80 的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液140 mL 中，于水浴加热45 ℃振摇30 min，混匀，作为1∶10 供试液。

2.4 铜绿假单胞菌检查方法适用性试验

试验组：取1∶10 供试液10 mL 和1 mL（含菌数<100 cfu）的铜绿假单胞菌菌悬液接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，混匀。

供试品对照组：取1∶10 供试液10 mL，稀释液代替菌液，同试验组操作。

阳性对照组：取不含聚山梨酯80 的稀释液（pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）取代供试液，同试验组操作。

阴性对照组：取2 瓶100 mL 胰酪大豆胨液体培养基，其中一瓶作为阴性对照1；另一瓶加入稀释剂（含10%聚山梨酯80 的pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）作为阴性对照2。

上述各组在35 ℃培养24 h 后，取培养物分别划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，在35 ℃培养，试验组与阳性对照组24 h 后有菌落生长，供试品组与阴性对照组继续培养72 h。若溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌；若溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上无菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判未检出铜绿假单胞菌。结果见表2。

表2 铜绿假单胞菌检查方法适用性试验结果

2.5 金黄色葡萄球菌检查方法适用性试验

试验组：取1∶10 供试液10 mL 和金黄色葡萄球菌菌悬液1 mL（含菌数<100 cfu）接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，混匀。

供试品对照组：取1∶10 供试液10 mL，稀释液代替菌液，同试验组操作。

阳性对照组：取不含聚山梨酯80 的稀释液（pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）取代供试液，同试验组操作。

阴性对照组取2 瓶100 mL 胰酪大豆胨液体培养基，其中一瓶作为阴性对照1；另一瓶加入稀释剂（含10%聚山梨酯80 的pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）作为阴性对照2。

上述各组在35 ℃培养24 h 后，取培养物分别划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，在35 ℃培养，试验组与阳性对照组24 h后有菌落生长，供试品组与阴性对照组继续培养72 h。若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上无菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判未检出金黄色葡萄球菌。结果见表3。

表3 金黄色葡萄球菌检查方法的验证结果

表2 及表3 结果显示，按照《中国药典》2015年版的规定进行控制菌方法适用性检查时，阳性对照试验组和试验组的试验菌都生长良好，阴性对照组均无菌生长，表明17 批样品在该条件下对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，说明采用该法进行金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查可行。

3 讨论

根据《中国药典》2015 年版四部非无菌产品微生物限度检查法中贴膏剂供试品的制备通则“取供试品，去掉防黏层，将粘贴面朝上放置在无菌玻璃器皿上，在粘贴面上覆盖一层无菌纱布，避免贴膏剂粘贴在一起。将处理后的贴膏剂放入盛有适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯80 或卵磷脂）稀释液的容器中，振荡至少30 min。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10 倍系列稀释”［13］，为了简化试验步骤，本试验最初按照药典规定，采取“取样品100 cm2，加入含30%无菌十四烷酸异丙酯的pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 mL，45℃保温振摇30 min”的方法，除了发现有些样品存在供试品溶解不完全的情况外，部分样品还出现了油水分层不明显的状况，需要增加萃取的步骤。经过反复试验，若将最后把加入的表面活性剂“无菌十四烷酸异丙酯”改为“聚山梨酯80”浓度确定为10%，即稀释液采用“含10%聚山梨酯80 的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液”，在此稀释液中，供试品溶解较为完全，油水分层明显，可以取水层作为1∶10 供试液，同时为了使供试品充分溶解，供试液制备方法中还加入了“将样品剪碎”的步骤。

综上所述，最后确定的供试液制备方法为“取供试品2 贴，去掉贴膏剂的保护层，放置在无菌操作台上，粘贴面朝上，用无菌纱布覆盖粘贴面，剪碎，将碎片置于含10%聚山梨酯80 的pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液140 mL 中，于水浴加热45 ℃振摇30 min，混匀，作为1∶10 供试液”。

本实验采用《中国药典》2015 年版四部通则1106 进行关节止痛膏控制菌微生物限度检查方法的分析，该试验方法操作步骤简便、准确度高，且具有仪器简单、快速、方便快捷的优点。