不同年份陈皮指纹图谱及黄酮类成分含量测定

周洁，黄海龙，余虹，高慧，李晶，叶喜德

1.抚州市临川区人民医院，江西 抚州 344100；2.江西中医药大学，江西 南昌 330004；3.江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330006

陈皮为芸香科植物橘Citrμs reticμlataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮，药材分为“陈皮”和“广陈皮”（又称新会陈皮），其中以广陈皮为质佳。陈皮始载于《神农本草经》，味苦、辛，性温，归肺、脾经，可理气健脾，燥湿化痰，常用于脘腹胀满，食少吐泄，咳嗽痰多等症［1］。中医传统理论认为陈皮“陈久者良”，如《名医别录》载有“橘皮疗气大胜，须陈久者良”［2］，《汤液本草》记“橘皮以色红日久者为佳”［3］。由于成分是影响药材质量与药效变化的关键因素，而陈皮中的黄酮类、生物碱类与挥发油等是其主要有效成分［4］，这些成分变化常受贮藏、加工炮制等因素影响，不同产地或不同年限陈皮中的成分种类、含量存在差异，其功效也存在差异［5］。虽然有学者对不同年份陈皮化学成分差异进行了研究，但多以广陈皮为研究对象［6-10］。江西省新干县三湖镇也是陈皮药材主要来源，即为大红袍，但根据该产地的陈皮研究不同年份之间的成分差异，目前文献仍属空白。基于此，本研究以江西道地药材陈皮为原材料，选择不同贮藏年限陈皮1 d、1 年、7 年为研究对象，运用HPLC 法建立其HPLC 指纹图谱，并对其主要成分橙皮苷、川陈皮素与橘皮素等黄酮类成分进行分析，以比较不同年份之间成分差异，并探讨其变化规律，为陈皮“陈久者良”提供科学数据支撑。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1100 高效液相色谱仪（安捷伦仪器有限公司）；FA1004N 万分之一电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；YF-111B（100 g）高速中药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）；KQ-500E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TDL-80-2C 低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；GZX-9076MBE 电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 材料

陈皮药材产地为江西省新干县三湖镇，经鉴定为芸香科植物橘（Citrus reticulataBlanco.）的干燥成熟果皮。对照品橙皮苷（批号：wks20030407）、川陈皮素（批号：wkq20031701）与橘皮素（批号：wkq20041611）质量分数均≥98%，购于四川省维克奇生物科技有限公司；乙腈、甲醇、磷酸（均为色谱纯，西陇科学股份有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

精密称定适量橙皮苷、川陈皮素、橘皮素标准品粉末，加甲醇溶解，制成质量浓度为橙皮苷0.962 5 mg/mL，川陈皮素0.054 5 mg/mL，橘皮素0.034 mg/mL 的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备

取1 d、1 年、7 年陈皮，打粉过三号筛，精密称定陈皮粉末约0.1 g，精密量取纯甲醇25 mL，超声提取（功率500 W，频率40 kHz）40 min 后放冷，甲醇补足减失的重量，摇匀，高速离心10 min，15 000 r/min，离心后取上清液，即得供试品溶液。取1 mL 置进样瓶备用。

2.3 色谱条件

Syncronis C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱，柱温35 ℃，流速1 mL/min，进样量为5 μL，流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱为0～8 min，20%（A）；8～18 min，20%～26%（A）；18～23 min，26%～46%（A）；23～37 min，46%～52%（A）；37～39 min，52%～10%（A）。指纹图谱检测波长为283 nm，含量测定采用双波长检测，0～23 min，检测波长283 nm；23～39 min，检测波长330 nm。

2.4 指纹图谱的方法学考察

2.4.1 精密度考察精密称取1 年陈皮粉末0.1 g，按“2.2”项下方法制备，按“2.3”项下色谱条件进行测定，连续进样6 次，以橙皮苷峰（6 号峰）为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，得相对保留时间RSD 为0.04%～0.27%，相对峰面积RSD 在0.50%～3.00%。结果显示仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性考察取同一供试品溶液，分别于 0、3、6、9、12、24 h 以“2.3”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，以橙皮苷峰（6 号峰）为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积。相对保留时间RSD 为0.04%～0.27%，相对峰面积RSD 为0.50%～3.00%，表明供试品溶液在 24 h 内稳定。

2.4.3 重复性考察按“2.2”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，以橙皮苷峰（6 号峰）为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，相对保留时间RSD 为0.04%～0.22%，相对峰面积RSD 在0.74%～2.87%，结果显示方法重复性良好。

2.5 指纹图谱建立及相似度评价

取1 d、1 年、7 年陈皮样品粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012.130723 版）”，以陈皮样品0年的图谱为参照图谱，选择多点校正进行匹配，生成对照特征图谱，见图1。将1 d、1 年、7 年陈皮供试品色谱图与对照品指纹图谱匹配，共确定13个共有色谱峰，进行相似度评价，结果得相似度分别为0.974、0.999、0.993，相似度均大于0.900，表明各年份陈皮的HPLC 指纹图谱相似度较高。

图1 不同贮存年限陈皮 HPLC指纹图谱

图2 陈皮对照指纹图谱

2.6 黄酮类成分的含量测定

2.6.1 对照品溶液的制备同“2.1”项下制备。

2.6.2 供试品溶液的制备同“2.2”项下制备。

2.6.3 色谱图色谱条件同“2.3”项下条件进行测定，对照品与供试品色谱图见图3。

图3 HPLC色谱图

2.6.4 方法学考察（1）线性关系考察。精密吸取“2.6.1”项下的混合对照品溶液，使用倍比稀释方法，加甲醇分别稀释2、4、8、16 和32 倍，得6份质量浓度不同的混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行进样测定，记录待测成分的色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），以进样质量浓度为横坐标（X），进行线性回归，计算线性回归方程，结果显示橙皮苷，川陈皮素和橘皮素在相应范围内线性关系良好，R2均大于0.999 0，具体见表1。

表1 橙皮苷、川陈皮素、橘皮素的线性回归方程

（2）精密度考察。精密称取1 年陈皮粉末0.1 g，按“2.2”项下方法制备，并按“2.3”项下色谱条件进行进样测定，连续进样6 次，分别记录峰面积，计算橙皮苷、川陈皮素和橘皮素峰面积RSD 为0.35%、0.30%、0.48%，结果显示仪器精密度良好。（3）稳定性考察。取同一供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、24 h 以“2.3”项下色谱条件进行进样测定，记录橙皮苷、川陈皮素和橘皮素成分的峰面积。计算得橙皮苷、川陈皮素和橘皮素峰面积RSD 分别为1.30%、1.49%和1.44%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。（4）重复性考察。取同一批陈皮粉末（1 年陈皮），按“2.2”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，计算橙皮苷、川陈皮素和橘皮素成分含量RSD 分别为1.60 %、1.08%、1.20%，结果显示方法重复性良好。（5）加样回收率试验。精密称取已测定的1 年陈皮粉末0.05 g，共6 份，分别按供试品待测指标成分含量100%，精密加入一定量的混合对照品溶液（橙皮苷3.047 2 mg/mL，川陈皮素0.455 6 mg/mL、橘皮素0.192 6 mg/mL），按“2.3”项下的色谱条件测定指标成分含量，测定其峰面积，计算指标成分的回收率，结果见表2。

表2 橙皮苷、川陈皮素、橘皮素的加样回收率

2.7 样品含量测定

分别取1 d、1 年、7 年陈皮各3 份，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算其橙皮苷、川陈皮素、橘皮素3个指标成分的含量，结果见表3。

表3 橙皮苷、川陈皮素、橘皮素的含量测定结果（mg/g）

3 讨论

3.1 提取溶剂的考察

平行称取3 份1 年陈皮粉末0.1 g，精密称定。分别加入50、70、100%甲醇25 mL，摇匀，超声提取40 min，放冷后补足减失的重量，摇匀后再高速离心（15 000 r/min，10 min），取上清液，所得3份供试品溶液用HPLC 进行测定。结果显示，以纯甲醇作为提取溶剂时，其橙皮苷提取率最高；而不同浓度的提取溶剂对川陈皮素和橘皮素的提取率影响不大，故选择纯甲醇作为提取溶剂。

3.2 提取时间考察

平行称取3 份1 年陈皮粉末0.1 g，精密称定。各精密加入100%甲醇25 mL，摇匀，分别超声提取20、30、40 min，放冷后补足减失的重量，摇匀后再高速离心（15 000 r/min，10 min）取上清液，所得3 份供试品溶液用HPLC 进行测定。结果显示，不同提取时间的橙皮苷、川陈皮素、橘皮素提取率差异不大，其中提取时间为40 min 时，各指标成分含量相对较高，故选择40 min 作为提取时间。

3.3 检测波长的选择

采用全波长扫描，考察不同吸收波长下各待测成分的图谱响应强度，结果发现283 nm 检测条件下，色谱峰较多，各峰吸收均匀，故选择283 nm 作为指纹图谱检测波长，其中橙皮苷在283 nm 附近有最大吸收峰，川陈皮素和橘皮素的最大吸收波长为330 nm。故本研究依照成分吸收所在波长不同，采用了双波长测定，选择283 nm 为橙皮苷检测波长，而330 nm 为川陈皮素、橘皮素检测波长。

3.4 不同年份陈皮成分含量变化情况

采用HPLC 对1 d、1 年、7 年陈皮中的橙皮苷、川陈皮素和橘皮素含量进行测定，发现陈皮中各成分含量，随储存年份不同而发生变化。在所选择的年限范围内，橙皮苷、川陈皮素和橘皮素含量变化范围分别为：36.680～61.770 mg/g、5.392～14.730 mg/g和2.211～6.132 mg/g。结果表明，橙皮苷含量随年限的增长呈升高之势，且含量相差较大；而川陈皮素与橘皮素的含量则随年限的增长而呈下降之势。

研究表明，陈皮所含黄酮类成分种类，受储存年限影响甚少，但所含橙皮苷含量相差较大，且其含量随放置时间延长而增加。由于橙皮苷为陈皮主要有效成分，故“陈久者良”之说具有一定科学依据［11-12］。也有学者认为广陈皮中橙皮苷含量随贮藏年限（1～19 年）延长先增加后降低，故难以得出陈皮“陈久者佳”之结论［13］；本研究选择江西大红袍为陈皮药材做为考察对象，陈皮中橙皮苷含量变化与储存时间密切相关。在考察不同年限川陈皮素、橘皮素等含量变化时，发现其含量变化与橙皮苷变化差异较大，并随储存年限延长而增加［14］，这与本研究结果不同。可见，通过分析不同贮藏年限陈皮中黄酮类成分含量变化差异，发现陈皮中的主要有效成分，除与受存储年限、存储时的条件和炮制加工等因素影响有关外，药材来源也是影响药材质量的主要因素［15］。虽然，存储年限会影响陈皮主要有效成分含量，但药效变化是否与含量变化有关，还是陈皮中多种成分变化产生的综合作用有关，仍有待研究。