高效液相色谱法测定多种硫化体系药用橡胶制品中游离硫含量

汪元亮，熊马剑，左军凤，朱碧君

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

药用胶塞是药品包装中常用于密封的组件，其具有优异的密封性、化学稳定性等特点［1］。药用胶塞常用的硫化体系使用硫或含硫化合物作为交联剂，硫化过程中交联剂难以反应完全，过量的硫或含硫化合物会产生游离硫，结果会导致胶塞出现“喷霜”现象［2-3］，对胶塞的性能有不利的影响。在后续的使用过程中，具有游离硫的胶塞与金属物品接触时会与金属反应，污染药品［4］。胶塞中游离硫含量也作为评价胶塞配方或硫化程度的指标［5］，因此胶塞中游离硫的含量测定具有重要意义。

2015 年版《国家药包材标准》中“挥发性硫化物测定法”（YBB00302004-2015）采用的硫斑法仅为限量考察［6］，准确度稍差。挥发性硫化物的测定有不同的方法［7-15］，游离硫遇酸即可生成挥发性的硫化氢，游离硫的测定也是挥发性硫化物测定的一种方法。国标中游离硫的测定方法有GB/T 3516-2006，其中包括亚硫酸钠法、铜螺旋法［16］，这两种方法操作过程烦琐、灵敏度和平行性均不理想。国内部分学者对游离硫提出了不同的测定方法［3，17-20］，均有各自的特点，但是对游离硫测定所涉及的胶塞均比较单一。本研究内容建立了高效液相法测定橡胶中游离硫的含量，测定样品涉及二十种不同种类的药用胶塞，专属性强，结果准确可靠。

1 材料与仪器

1.1 试剂试药

升华硫（LOT：20200109，国药）；二硫化四乙基秋兰姆（CCAD300202，美国CATO）、一硫化四甲基秋兰姆（C10083427，上海麦克林）、四异丙基二硫化秋兰姆（Lot：ZZS-21-S034-B1，ZZSTANDARD）、二硫化四丁基秋兰姆（D10211，美国BPS）、二硫化四甲基秋兰姆（CCPD100803，美国CATO）、硫化树脂、烷基苯酚二硫化物、聚对叔丁基苯酚二硫化物(P909950，上海麦克林）、噻唑（D-10201，美国BPS）、6-（二丁基氨基）-1,3,5-三嗪-2,4-二硫醇（D462763，加拿大TRC）、促进剂DZ（Lot：AMD-091-02,美国BPS）、促进剂NS（10203，美国BPS）、促进剂CZ（CCHM701218，美国CATO）、促进剂NOBS（CCHM701837，美国CATO）。无水乙醇（国药）、甲醇（阿拉丁）。

1.2 实验仪器

高效液相色谱仪（LC-20ADXR，日本岛津公司）；电子分析天平（AL204C，梅特勒-托利多公司）。色谱柱：Shim-pack GIST C18 5 µm，4.6 mm×250 mm。

1.3 试验样品

本试验共收到来自A 公司（3 批）、B 公司（12批）、C 公司（4 批）、D 公司（14 批）共计20 个品种33 批样品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～15 min，90%A；15～20 min，95%A；20～30 min，90%A）。柱温：35 ℃；检测波长：264 nm；进样量：10 µL。

2.2 对照溶液的制备

对照储备液：称取升华硫对照品约10 mg，加无水乙醇超声溶解并定容至100 mL。

对照溶液：分别量取适量对照储备液，用无水乙醇稀释至硫浓度分别为10、20、40、60、80、100 μg/mL 的系列对照液。

2.3 供试品溶液的制备

取样品适量，总表面积为20±2 cm2，置于250 mL 圆底烧瓶中，精密加入50 mL 无水乙醇，称重，回流6 h，补足重量，过滤后，供测定。

2.4 方法学研究

2.4.1 提取溶剂的筛选取总表面积约20 cm2样品，分别置于250 mL 圆底烧瓶中，精密加入无水乙醇、水、甲醇、丙酮各50 mL，称定重量，回流4 h，冷至室温后补足重量，滤过，精密量取续滤液，照上述色谱条件测定，记录游离硫峰面积，结果无水乙醇回流4 h，所得硫含量最高提取更完全（见表1），因此选择无水乙醇作为提取溶剂。

表1 不同提取溶剂测定结果

2.4.2 提取时间的考察取总表面积约20 cm2样品若干份，置于250 mL 圆底烧瓶中，分别精密加入50 mL 无水乙醇回流不同时间后，补足重量，过滤后测定，记录游离硫峰面积，结果见图1，根据结果选择无水乙醇回流6 h 作为样品提取条件。

图1 不同提取时间的测试结果

2.4.3 系统适用性试验量取升华硫和［二硫化四乙基秋兰姆、一硫化四甲基秋兰姆、四异丙基二硫化秋兰姆、二硫化四丁基秋兰姆、二硫化四甲基秋兰姆、硫化树脂、烷基苯酚二硫化物、聚对叔丁基苯酚二硫化物、噻唑、6-（二丁基氨基）-1,3,5-三嗪-2,4-二硫醇、促进剂DZ、促进剂NS、促进剂CZ、促进剂NOBS］适量，按“2.1”项色谱条件进样，记录色谱图（见图2～图5）。经对照溶液定位知：S 与其他硫化剂或促进剂的峰分离良好，理论板数n>3 000。

图2 游离硫与其他14种硫化剂或硫化促进剂的色谱图

图3 升华硫-S对照溶液色谱图

图4 样品色谱图

图5 空白溶剂色谱图

2.4.4 标准曲线考察取对照品储备液适量，用无水乙醇稀释至硫浓度分别为10、20、40、60、80、100 μg/mL 的系列对照液。按上述条件测定，记录色谱图，以峰面积（y）对浓度（x）进行线性回归。结果线性良好，线性方程y=6.4954E-07x+0.001 4，r=0.999 9。

2.4.5 检测限取对照品溶液适量，用无水乙醇逐步稀释后进样，以信噪比约3 时作为检测限，结果对照液检测限浓度为0.05 μg/mL，样品检出限为0.125 μg/cm2。

2.4.6 定量限取对照品溶液适量，用无水乙醇逐步稀释后进样，以信噪比约10 时作为定量限，结果定量限为0.375 μg/cm2。

2.4.7 溶液稳定性取上述混合对照品溶液，分别于0、2、4、6、12、24、48 h 进样10 μL，考察溶液稳定性。试验结果表明，对照溶液在24 h 内结果稳定。见表2。

表2 稳定性试验结果

2.4.8 精密度试验取混合对照品溶液，按方法测定，连续进样6 次，结果精密度良好，见表3。

表3 精密度试验结果

2.4.9 回收率试验取预灌封注射器用聚异戊二烯橡胶针头护帽，计总表面积约10 cm2样品，分别加入硫对照品0.6、0.8、1.0 mg，混匀。照方法操作，平行3 份。试验结果见表4。

表4 回收率试验结果

2.5 结果

取样品，照方法测定，结果见表5，结果显示：33 批样品中，有31 批样品检测出游离硫，其中预灌封注射器用聚异戊二烯橡胶针头护帽检出量最大，按面积计算为0.086 1 mg/cm2，另外有两批未检出。

表5 样品中游离硫测定结果

表5 样品中游离硫测定结果（续）

3 讨论

经对收集的20 种共33 批样品进行硫含量的测定，部分胶塞中游离硫的测定结果远大于YBB 标准中硫斑法的限值，YBB 方法与本法的样品处理过程并不相同，YBB 前处理为121℃/30 min，而本方法采用乙醇回流6 h 提取，两种方法所提取的硫含量并不相同，本法中提取游离硫的定义不仅包括原有的游离硫，还包括在回流过程中，S 健断裂，新生成的游离硫，所以其测定结果值较大。通过对不同种类的胶塞的测定结果比较，硫磺系的测定结果最大，主要是硫磺体系在硫化过程中主要是形成多硫键，结构稳定性较差，容易出现硫化还原现象，因此药用胶塞体系中和药物直接接触的应尽量减少硫磺体系的使用。