止嗽散对咳嗽变异性哮喘大鼠气道炎性反应及外周血Th1/Th2平衡的影响

胡佳 沈波

摘要 目的：探讨止嗽散对咳嗽变异性哮喘大鼠气道炎性反应及外周血Th1/Th2平衡的影响。方法：48只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、地塞米松组（0.2 mg/kg）、止嗽散高（12.6 g/kg）、中（6.3 g/kg）、低（3.1 g/kg）剂量组，每组8只。以卵白蛋白（OVA）致敏激发法制备大鼠咳嗽变异性哮喘模型，检测各组大鼠血液中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及淋巴细胞含量，采用酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）测定血清和肺泡灌洗液（BALF）中IL-4和IFN-γ水平，同时做肺脏的组织病理学检测。结果：止嗽散高剂量组大鼠血液嗜酸性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值降低，血清和BALF中IL-4含量降低，IFN-γ含量升高，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）;同时能够改善肺脏组织炎性细胞浸润，减轻纤维结缔组织增生。结论：止嗽散可以通过降低血清和BALF中IL-4含量，升高IFN-γ含量，调节Th1/Th2的免疫失衡，改善咳嗽变异性哮喘症状。

关键词 止嗽散;咳嗽变异性哮喘;白细胞介素4;γ-干扰素;气道炎性反应;免疫平衡

Effects of Zhisou Powder on Airway Inflammation and Th1/Th2 Balance

in Peripheral Blood of Rats with Cough Variant Asthma

HU Jia，SHEN Bo

（Nanjing Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital，Affiliated

with Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 240014，China）

Abstract Objective：To explore the effects of Zhisou Powder on airway inflammation and Th1/Th2 balance in peripheral blood of rats with cough variant asthma.Methods：A total of 48 male SD rats were randomly divided into a normal control group，a model control group，a dexamethasone group（0.2 mg/kg），a Zhisou Powder high-dose（12.6 g/kg），a medium-dose（6.3g/kg）and low-dose（3.1 g/kg）groups，with 8 rats in each group.Sensitized with ovalbumin（OVA）excitation of cough variant asthma model rats，each rat blood eosinophils and neutrophils and lymphocytes in content was detected.Enzyme-linked immune sorbent assay（ELISA）was used to determine serum and alveolar lavage fluid（BALF）of IL-4 and IFN-gamma level.At the same time lung tissue pathology testing was done.Results：The absolute value of eosinophil and lymphocyte in blood of rats，the content of IL-4 and IFN-γ in serum and BALF in Zhisou Powder high-dose group were decreased，and the differences were significant compared with model group（P<0.01，P<0.05）.At the same time，it can improve inflammatory cell infiltration of lung tissue and reduce fibrous connective tissue hyperplasia.Conclusion：Zhisou Powder can reduce the content of IL-4 in serum and BALF，increase the content of IFN-γ，regulate the immune imbalance of Th1/Th2 and improve the symptoms of cough variant asthma.

Keywords Zhisou Powder; Cough variant asthma; IL-4; IFN-γ; Airway inflammation; Immunologic balance

中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.009

咳嗽变异性哮喘（Cough Variant Asthma，CVA），又称咳嗽性哮喘，是以慢性咳嗽为主要或唯一临床表现的一种特殊类型哮喘。调查显示，我国CVA已占慢性咳嗽病因诊断中的14%～62%，成为慢性咳嗽的主要原因之一[1-2]，长期西药治疗的患者疗效较不显[3]。本研究拟从止嗽散对CVA大鼠气道炎性反应及外周血Th1/Th2平衡的关系着手，以动物模型为载体，探讨止嗽散的科学内涵。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级的SD雄性大鼠48只，体质量（200±10）g，购于浙江省实验动物中心，许可证号：SCXK（浙）2014-0001。在给SD大鼠上药前后，分别将其安放在不同的笼内饲养，每只笼内5只，喂食饲料为全价颗粒鼠饲料（南京协同生物工程有限公司提供），让其自由饮水及饮食，室内温度控制在20～25 ℃，人工光照时间达到12 h/d，保持良好的室内通风，所在实验室内的相对湿度维持在：65%～70%。本研究得到南京市中西医结合医院伦理委员会的批准，并在此批准下进行（伦理审批号：宁中西伦字【2018】23号）。

1.1.2 药物 止嗽散组方：桔梗（炒）10 g、荆芥10 g、紫菀10 g、百部10 g、白前10 g、炙甘草5 g、陈皮5 g，对上述中药进行质量标准控制后由南京市中西医结合医院制剂室深加工，煎成水剂，浓缩至200 mL，备用。

1.1.3 试剂与仪器 地塞米松（浙江省仙琚制药股份有限公司，批号：1505102）;卵白蛋白OVA（北京索莱宝生物科技有限公司，批号：709B051）;氢氧化铝干粉（上海美兴化工股份有限公司，批号：14100）;IFN-γELISA试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，批号：E20171001A）;IL-4 ELISA试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，批号：E20171001A）;全波长酶標仪（Thermofisher Scientific公司，美国，型号：Synergy HT）;分析天平（岛津公司，日本，型号：AUW120D）;鱼跃雾化器（武汉科康兴达医疗器械有限公司，型号：403M）;血液分析仪（SIEMENS公司，德国，型号：ADVIA 2120i）

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 健康SD大鼠以新制的10%卵蛋白（OVA）和氢氧化铝混合物1 mL，皮下注射致敏，每只大鼠共取10处，分别为：两后足跖部、腹股沟部、腰部、背部、颈部，每处给其注射0.05 mL，同时注射0.5 mL在腹腔，1周后再加强1次。造模后第15天的上午行雾化吸入：将大鼠放在4 L玻璃制钟罩内，在400 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）恒压下，用超声雾化器将1% OA溶液喷入20 min，从而激发大鼠哮喘。模型评估：在激发大鼠时观察其反应，咳嗽、竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕、极度烦躁，以上症状出现2种或2种以上者，或出现抽搐、虚脱2种现象之一，判定为造模成功[4-7]。将48只大鼠随机分为以下6组：正常对照组、模型对照组、地塞米松组，止嗽散低、中、高剂量组，每组8只。

1.2.2 干预方法 造模成功后，给组大鼠连续给药14 d，第15天处死大鼠，留取标本。地塞米松组给药剂量为0.2 mg/kg（相当于60 kg体质量成人用量），止嗽散给药剂量分别为高剂量组（12.6 g生药/kg），中剂量组（6.3 g生药/kg）、低剂量组（3.1 g生药/kg），大鼠造模成功后灌胃给药，1次/d，高、中、低剂量组给药量分别相当于60 kg体质量成人用量的5、10、15倍。正常对照组、模型组同步以蒸馏水灌胃，1次/d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 血清制备 末次给药后先将大鼠禁食（可自由饮水）24 h，腹腔注射乌拉坦（1.5 g/kg）麻醉，眼眶取血，部分血液做血常规检测，部分血液3 000 r/min，离心半径10 cm，离心10 min，取上层血清，-20 ℃贮存待检测。

1.2.3.2 大鼠肺泡灌洗液（BALF）制备 取血后，采用仰卧位将大鼠固定于操作台。把大鼠颈部皮肤剪开，使其气管充分暴露在外，剪一小口于气管正中处，将右肺门根部结扎。气管插管使用外径1.8 cm的静脉导管，感到轻阻时，判断插管已到达气管隆突部，将插管向左旋转，轻微用力后方可成功进入左主支气管，新阻力遇到时即停止插管，这时表明导管已到左主支气管下端分叉。用5 mL的注射器抽入37 ℃生理盐水4 mL，将盐水用导管慢速注入肺内，肉眼可见左肺渐渐苍白、膨大。轻按30 s肺组织，随后将注射器缓慢回抽，再在肺内缓慢注入所得液体，重复操作10次，末次操作时，一边回抽盐水一边缓慢外拔插管约3.5 cm至气管，随后把回抽液放入15 mL塑料离心管（冰浴中）。以上操作为第1次灌注，其后重复上述操作3次，将3次收集的BALF均匀混合，回收液以1 500 r/min（离心半径10 cm）离心5 min，取上清液，-20 ℃贮存待检测。

1.2.3.3 大鼠肺组织制备 BALF收集完毕后，将动物处死，取组织，定位于右肺下叶相近部位，10%甲醛固定组织，以常规石蜡包埋，切片厚4～5 μm，HE染色。HE染色步骤：60 ℃恒温烤箱烤片（2 h），二甲苯I（6 min），二甲苯Ⅱ（5 min），无水乙醇I（2 min），无水乙醇Ⅱ（2 min），95%乙醇（1 min），80%乙醇（1 min），70%乙醇（1 min），自来水水洗3次，将水控净后苏木精（3 min），自来水水洗3次，1%盐酸乙醇分化（5s），自来水水洗3次，0.5%氨水返蓝（30 s），自来水水洗3次，1%伊红水溶液（2 min），自来水水洗3次，70%乙醇（1 min），80%乙醇（1 min），95%乙醇（1 min），无水乙醇I（2 min），无水乙醇Ⅱ（2 min），无水乙醇Ⅲ（2 min），二甲苯I（1 min），二甲苯Ⅱ（3 min），二甲苯Ⅲ（3 min），中性树胶封片。

1.2.3.4 IFN-γ、IL-4 ELISA检测步骤 先将试剂盒平衡至室温（20～28 ℃），再把标准品依照每孔各 （50 μL）做标记;把处理好的待测样本按每孔各（50 μL）依次加入并标记;将（50 μL）酶联亲和物分别加入至标准品孔和待测样本孔中，充分摇匀。将包被微孔板覆膜，在37 ℃孵育反应60 min，然后充分弃尽孔内剩余残夜，用事先稀释准备好的清洗液重复冲洗5次，并将孔内剩余液扣干;将底物Ⅰ和Ⅱ各（50 μL）依次加入每孔，充分的摇匀。放在室温下，避免光线的条件下，反应15 min;反应后，在每孔中分别将终止液（50 μL）加入，摇匀，反应终止;用酶标仪30 min内在450 nm下获取OD值;横坐标为标准品浓度，纵坐标为OD值，绘制标准曲线;可在标准曲线上依据血清样品的0D值查出其浓度。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 7.0统计软件进行数据分析，所涉数据以均数±标准差来表示（±s），全部计量资料均采用Student-t检验，计数资料采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察 空白对照组大鼠反应灵敏，呼吸平稳，毛色光洁。吸入OVA不久后，模型组及给药大鼠立即出现躁动不安，搔抓颜面皮毛，呼吸急短，咳嗽时发、毛竖立，活动频率骤然降低或俯卧静止的现象。伴随激发频次增多，以上症状增多并加重，经连续激发后毛发暗淡，迟钝性反应，呼吸频率及呼吸幅度明显紊乱。与模型组对照比较，止嗽散高、中、低剂量组症状减轻，但仍存在呼吸急促及呼吸困难症状。

2.2 止嗽散对CVA大鼠血常规的影响 造模后，模型组大鼠血常规淋巴细胞绝对值升高，与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），嗜酸性粒细胞绝对值、中性粒细胞绝对值升高，但与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。止嗽散给药治疗后，高剂量组嗜酸性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值下降，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05），低剂量组中性粒细胞绝对值下降，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3 止嗽散对CVA大鼠血清和BALF中IFN-γ、IL-4含量的影响 造模后，模型组大鼠血清及BALF中的IL-4含量增多，IFN-γ含量减少，与空白组比较差异有统计学意义（P<0.01）。止嗽散给药治疗后，高剂量组大鼠血清和BALF中IL-4含量降低，IFN-γ含量升高，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。止嗽散中剂量组的血清IL-4含量减少，较模型组差异有统计学意义（P<0.05）。见表2、表3。

2.4 止嗽散对CVA大鼠肺脏组织的影响 大鼠处死后，取其肺脏，10%福尔马林固定。石蜡包埋切片，切片厚约4～5 μm，HE染色。根据病变轻重程度，依次半定量为轻度“+”，中度“++”，重度“+++”，无病变组织标记为“—”。空白对照组：本组8例，肺脏肺泡结构清晰，肺泡上皮完整，肺泡壁毛细血管无扩张充血，腔内无渗出物，间质少量慢性炎细胞浸润。模型组：本组8例肺脏多灶性炎性细胞浸润（+-++），可见纤维结缔组织轻度增生（+）。地塞米松组：本组8例肺脏，4例肺脏多灶性炎性细胞浸润（+），4例肺脏可见纤维结缔组织轻度增生（+）。止嗽散高剂量组：本组8例肺脏，5例肺脏可见多灶性炎性细胞浸润（+），4例肺脏可见纤维结缔组织轻度增生（+）。止嗽散中剂量组：本组8例肺脏，5例肺脏可见多灶性炎性细胞浸润（+-++），7例肺脏可见纤维结缔组织轻度增生（+）。止嗽散低剂量组：本组8例肺脏，7例肺脏可见多灶性炎性细胞浸润（+-++），8例肺脏可见纤维结缔组织轻度增生（+）。见图1。

3 讨论

现代研究显示CVA与气道高敏性、气道神经调节、炎性反应、免疫学和遗传学及环境、感染等因素有关[8-10]。其中，大多数学者认为CVA的病生理改变都是以持续气道慢性炎性反应与气道高反应性（BHR）为本质特征[11-12]，其次，现代研究表明，在相同环境下，不同个体患病风险不同，而这种易感性差异取决于Th1辅助细胞与Th2辅助细胞之间的免疫平衡，是机体发病及持续存在疾病状态的免疫学基础。Th1辅助细胞具有增强吞噬细胞介導的抗感染免疫功能，Th2辅助细胞具有诱导过敏反应的功能，因此，通过增强Th1型反应，抑制Th2型反应可有效改善哮喘治疗效果[13-14]。Th1及Th2细胞的特征性细胞因子分别有IFN-γ、IL-4，在哮喘发病过程中CD4+T细胞的分化和功能从正性负性2方面均受其控制[15]。

CVA属于中医“咳嗽”的范畴，《黄帝内经》云：“五脏六腑皆令人咳，非独肺也。然肺为气之主，诸气上逆于肺，则呛而咳，是咳嗽不止于肺，而不离于肺”。中医理论人认为，肺为娇脏，易受内外之邪侵袭而为病，病则宣肃失常，肺气上逆，发为咳嗽。治当疏风宣肺，理气止咳。止嗽散是《医学心悟》的名方之一，在CVA的治疗方面得到广泛应用，具有辛温解表，宣肺疏风，止咳化痰之功效。温润和平，温而不燥，润而不腻，散寒不助热，解表不伤正[16-18]。

本研究结果表明，止嗽散高剂量组大鼠血液中嗜酸性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值降低，血清和BALF中IL-4含量降低，IFN-γ含量升高，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。同时能够改善肺脏组织炎性细胞浸润，减轻纤维结缔组织增生。结果提示止嗽散可以通过降低血清和BALF中IL-4含量，升高IFN-γ含量，调节Th1/Th2的免疫失衡，改善CVA症状。

参考文献

[1]吕寒静，邱忠民.2009年版咳嗽诊治指南的解读[J].临床药物治疗杂志，2011，9（6）：6-10.

[2]陈瑞，郑锐.老年咳嗽变异性哮喘的诊治进展[J].实用老年医学，2020，34（9）：870-872.

[3]刘文耀，包伟.止嗽散加减治疗变应性咳嗽临床观察[J].光明中医，2020，35（17）：2721-2722.

[4]吴尚华，沈玉鹏，杨志华，等.自拟宣肺定喘汤对咳嗽变异性哮喘模型大鼠血清IFN-γ和IL-4水平的影响[J].西部中医药，2017，30（1）：14-16.

[5]Nishitsuji M，Fujimura M，Oribe Y，et al.A guinea pig model for cough variant asthma and role of tachyki-nins.Exp Lung Res[J].Experimental lung research，2005，30（8）：723-737.

[6]李玉清，李兰珍，高建平.温肺化饮法对支气管哮喘大鼠血清IFN-γ、IL-4及ADAM33蛋白表达的影响[J].中医研究，2017，30（7）：66-68.

[7]刘贵颖，张慧琪，朱振刚，等.卵清蛋白致敏大鼠支气管哮喘模型的制备[J].临床肺科杂志，2013，18（7）：1167-1169.

[8]苗青，魏鹏草.咳嗽变异性哮喘的研究进展[J].实用医学杂志，2011，27（10）：1717-1718.

[9]孙晓琳，赵蕴伟，李爽.血清25-（OH）D3与IL-4在咳嗽变异性哮喘中的研究进展[J].微量元素与健康研究，2021，38（1）：78-79.

[10]刘莎，刘芳君，符州，等.气道反应性测定在婴幼儿咳嗽变异性哮喘诊断中的价值[J].中华实用儿科临床杂志，2020，35（21）：1624-1628.

[11]Wasserman SI.Basic mechanim in asthma[J].Ann Allergy，2013，14（1）：43.

[12]孙千惠，司东旭，阎玥，等.咳嗽变异性哮喘（CVA）进展影响因素的Meta分析[J].海南医学院学报，2019，25（23）：1818-1828.

[13]Gibbons F K，Israel E，Deykin A，et al.The combined effects of zafirlukast，prednisone，and inhaled budesonide on IL-13 and IFNgamma secretion[J].J Clin Immunol，2013，25（5）：437-444.

[14]孙洮玉，杨斌，徐荣谦，等.加味芎蝎散对咳嗽变异性哮喘大鼠咳嗽反应及气道平滑肌中IL8-CXCR1通路蛋白表达的影响[J].中华中医药学刊，2020，38（2）：8-10，后插1.

[15]Bousquet J，Knani J，Dhivert H，et al.Quality of life in asthma.I.Internal consistency and validity of the SF-36 questionnaire[J].Am J Respir Crit Care Med，1994，149（2 Pt 1）：371-375.

[16]張红燕，丁天红.止嗽散临床运用体会[J].现代中医药，2019，39（6）：122-126.

[17]高继强.止嗽散加减治疗慢性支气管哮喘急性发作的疗效评价[J].中国处方药，2019，17（3）：82-83.

[18]张至强，李泽庚，童家兵，等.止嗽散治疗咳嗽变异型哮喘研究进展[J].湖北中医药大学学报，2018，20（3）：118-121.

（2019-09-16收稿 责任编辑：王明）

基金项目：国家自然科学基金项目（81473609）;江苏省中医药局科技项目（YB2015070）

作者简介：胡佳（1984.10—），女，博士研究生在读，主治中医师，研究方向：内科疾病的中西医诊疗，E-mail：12712648@qq.com

通信作者：沈波（1985.06—），男，硕士，主治中医师，研究方向：内科疾病的中西医结合诊疗，E-mail：253951220@qq.com