橙皮苷对果糖饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠的作用研究

李晓霞 许莹 徐波 郑小岚 张元杰 韩菊平

摘要 目的：研究橙皮苷對高果糖加高脂饲料饮食诱导的非酒精性脂肪肝病（NAFLD）小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）和固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP-1c）表达的影响。方法：昆明小鼠60只，雄性，随机分为正常组、模型组、阳性药物多烯磷脂酰胆碱组，以及橙皮苷低、中和高剂量组，每组10只，除正常组给予普通饲料和普通水喂养外，其余5组给予10%的果糖水+高脂饲料喂养8周构建NAFLD模型，治疗4周后处死，检测肝功能AST、AST，血脂和肝脂TG、TC，观察肝脏病理学，同时检测肝脏组织中PPARα和SREBP-1c蛋白及mRNA的表达。结果：肝脏病理学HE染色可见，正常组切片正常，模型组出现明显脂肪空泡，与模型组比较，各观察组均有明显好转;与正常组比较，模型组AST、ALT、血清TG、血清TC、肝脏TC和肝脏TG均明显升高（P<0.05），各观察组相较于模型组明显降低（P<0.05），此外橙皮苷高剂量组和多烯磷脂酰胆碱组差异无统计学意义;与正常组比较，模型组PPARα明显降低（P<0.05），SREBP-1c明显升高（P<0.05），橙皮苷治疗后PPARα明显升高（P<0.05），SREBP-1c则明显降低（P<0.05），此外橙皮苷高剂量组和多烯磷脂酰胆碱组没有差异。结论：橙皮苷可明显降低高果糖+高脂饮食诱导的NAFLD小鼠肝脏组织中SREBP-1c表达，同时升高PPARα表达，进而调节血脂，保护肝脏。

关键词 橙皮苷;果糖;非酒精性脂肪肝;小鼠;过氧化物酶体增殖物激活受体α;固醇调节元件结合蛋白1c

Effects of Hesperidin on Nonalcoholic Fatty Liver Rats Induced by High Fructose Diet

LI Xiaoxia1，2，XU Ying1，XU Bo1，ZHENG Xiaolan1，ZHANG Yuanjie1，HAN Juping1，2

（1 The Fifth Hospital of Wuhan，Wuhan 430050，China; 2 The Second Affiliated Hospital，

Jianghan University，Wuhan 430050，China）

Abstract Objective：To study the effect of hesperidin on peroxisome proliferator-activated receptor alpha（PPARα）and sterol regulatory element binding protein 1 c in high-fructose and high-fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）mice.Methods：A total of 60 male Kunming mice were randomly divided into a normal group，a model group，a positive drug polyene phosphatidylcholine group，and a hesperidin low，medium and a high dose groups，with 10 in each group.Except for the normal group being fed with ordinary feed and ordinary water，the other 5 groups were fed with 10% fructose water+high-fat feed for 8 weeks to construct a NAFLD model.After 4 weeks of treatment，the mice were sacrificed and detected the liver function AST，AST，blood lipids and hepatic lipids TG，TC.Liver pathology was observed and the expression of PPARα and SREBP-1c protein and mRNA in liver tissue was detected.Results：Hepatic pathology HE staining showed that the slices in normal group was normal，and in the model group showed obvious fat vacuoles.Compared with the model group，each observation group were improved significantly.Compared with the normal group，AST，ALT，serum TG，serum TC，liver TC and liver TG in the model group were significantly increased（P<0.05），and the observation groups were significantly lower than them in the model group（P<0.05），there was no difference between the hesperidin high dose group and the polyene phosphatidylcholine group.Compared with the normal group，the PPARα was significantly lower in the model group（P<0.05），SREBP-1c was significantly higher（P<0.05），and the PPARα was significantly increased after hesperidin treatment（P<0.05），and SREBP-1c was significantly lower（P<0.05）.In addition，there was no difference between the high dose hesperidin group and the polyene phosphatidylcholine group.Conclusion：Hesperidin can significantly reduce the expression of SREBP-1c in the liver tissue of NAFLD mice induced by lowing high fructose+high fat diet，and increase the expression of PPARα，thereby regulating blood lipids and protecting liver.

Keywords Hesperidin; Fructose; Nonalcoholic fatty liver（NAFLD）; Mouse; Peroxisome proliferators-activated receptor α（PPARα）; Sterol regulatory element binding protein 1c

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.011

非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是临床中常见的一种脂代谢紊乱型疾病，本病与中心性肥胖、高血压、高血脂、高血糖和胰岛素抵抗等多种疾病密切相关，发生机制目前国内外接受的主要为二次打击学说[1-2]。近年来研究发现，高果糖饮食特别是高果糖高脂饮食可能是本病的发生核心之一，且可能是二次打击学说中第一次打击形成的核心因素[3]。目前对于高果糖脂肪肝病的研究还缺少相关文献报道，本研究着眼于此，采用高果糖高脂饮食构建NAFLD小鼠模型，采用橙皮苷（橙皮苷具有较强和广泛的药理活性，已有的研究显示，橙皮苷在抗氧化、抗菌、调节免疫力等多方面均具有很好的应用价值[4]。治疗之后，从过氧化物酶体增殖物激活受体α（Peroxisome Proliferators-activated Receptor α，PPARα）和固醇调节元件结合蛋白1c（Sterol Regulatory Element-binding Protein-1c，SREBP-1c）研究并分析橙皮苷对其的作用机制，为今后高果糖脂肪肝病的治疗提供夯实的理论学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 小鼠、小鼠饲料和高脂饲料均购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，小鼠为昆明种小鼠，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（鄂）2008-010），SPF级，共60只，雄性（雌性可分泌雌性激素，雌性激素对脂肪肝本身有一定的治疗作用，所以全部选用雄性大鼠），在购买后饲养于武汉科技大学医学院动物实验中心，温度22～26 ℃，湿度55%～65%，光照/黑暗=12 h/12 h，伦理审批号：五医伦理KY【YJ2018009】。

1.1.2 药物 橙皮苷（98%）购于雅安太时生物科技股份有限公司，货号：520-26-3;多烯磷脂酰胆碱购于赛诺菲安万特（北京）制药有限公司，国药准字H20059010。

1.1.3 试剂与仪器 果糖（98%）（上海甄准生物科技有限公司，货号：ZCC-20516）;苏木素伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色液（江苏碧云天生物科技公司，货号：C0105M）;肝脏三酰甘油（Triglyceride，TG）（货号：A110-2-1）和肝脏总胆固醇（Total Cholesterol，TC）（货号：A111-2-1）试剂盒购于南京建成生物工程研究所;过氧化物酶体增殖物激活受体α（Peroxisome Proliferators-activated Receptor α，PPARα）抗体（货号：sc-398394）、固醇调节元件结合蛋白1c（Sterol Regulatory Element-binding Protein-1c，SREBP-1c）抗体（货号：sc-365513）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrog Nase，GAPDH）抗体（货号：sc-47724），购于美国Santa公司;二抗（北京中杉金桥生物科技公司，货号：ZB-2301）;引物[生工生物工程（上海）股份有限公司，货号：S0131]。

电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司，型号：DK-S22）;高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂，型号：TGL-16C）;高速组织匀浆机（金坛市宏华仪器厂，型号：FHS-2A）;分光光度计（上海精密仪器仪表公司，型号：759S）;全自动生化分析仪（罗氏公司，瑞士，型号：RL7600D）;显微镜（厦门麦克奥迪实业集团有限公司，型号：B5-223IEP）;切片机（莱卡公司，德国，型号：RM2245L）;蛋白电泳系统（Bio-Rad公司，美国，型号：Mini-protean）;实时荧光定量PCR（qPCR）仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司，型号：ProFlexTM]。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 参考文献报道方法[5]，64只小鼠在购买后即分组，其中12只为正常组，其余52只为造模组，造模时正常组只给予普通饲料和蒸馏水喂养，造模组则给予高脂饲料喂养，同时日常饮用10%的果糖水，连续喂养8周。8周后，正常组和模型组各抽取2只小鼠，收集肝脏做病理学切片，当病理学切片结果小鼠肝脏有明显脂肪空泡时确认造模成功。造模成功后，基于随机数字发，将造模组其余50只小鼠分为5组，分别为模型组、多烯磷脂酰胆碱组、橙皮苷低、中和高剂量组，每组10只。

1.2.2 给药方法 治疗时正常组和模型组给予5 mL/（kg·d）生理盐水灌胃，多烯磷脂酰胆碱观察组给予多烯磷脂酰胆碱23.3 mg/（kg·d）治疗、橙皮苷低、中和高剂量组则分别给予橙皮苷80 mg/（kg·d）、160 mg/（kg·d）和320 mg/（kg·d）治疗，连续给药4周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 组织收集方法 治疗4周后，各组小鼠给予禁食不禁水12 h，以第4周末，各组小鼠禁食不禁水12 h后，以40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉后固定于解剖版，腹主动脉取血法收集小鼠血液，血液收集后立即离心，3 000 r/min，离心半径5 cm，离心10 min后，后收集血清，一部分交由我院检验科完成肝功能AST、ALT、血脂TG和TC的检测，其余置入超低温冰箱中保存。完成后，统一將肝左叶置入福尔马林溶液中保存用于病理学检测，其余组织分成四小块用于TG、TC和相关蛋白酶及mRNA表达的检测。

1.2.3.2 肝脂指标检测方法 肝脏TG和TC的检测，按照试剂盒提供的说明书进行，之后采用分光光度计检测得到数值，根据试剂盒说明书提供的计算公式计算即完成。

1.2.3.3 组织病理学检测 从福尔马林溶液中取出肝脏组织后，按照文献报道方法[6]，自来水冲洗24 h，乙醇脱水、二甲苯透明，石蜡包埋、切片机切片、苏木精染色，伊红复染，中性树脂封片。完成后显微镜下收集图像即可，每个切片选取4个不同的视野。

1.2.3.4 Western-blot检测PPARα和SREBP-1c蛋白表达水平 选用组织蛋白裂解液将组织充分碾磨后提取上清，采用BCA法对其定量后调平，然后每组取50 μg行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳完成后转移到PVDF膜，脱脂牛奶封闭2 h，一抗过夜孵育后于次日取出，TBS/T洗涤3次后，加入二抗1 h，暗室曝光洗片收集图像，采用Image J比较各组条带的灰度值即可。

1.2.3.5 实时荧光PCR检测PPARα和SREBP-1c mRNA表达水平 用天根总RNA试剂盒提取总RNA后，将其逆转录成cDNA，完成后对其进行PCR扩增反应，扩增条件为：94 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s、58 ℃ 10 s、72 ℃ 10 s（38 cycle），引物设计为，PPARα上游：5′-AGTTC GGTAACCTACGTGCC-3′;下游：3′-CACGTGTAACAAGTGGGGAC-5′;产物长度为：162bp;SREBP-1c上游：5′-CAGTGATCATGGACTCTGCC-3′;下游：3′-CACAGGGTAATGCGGTAGAC-5′;产物长度为：162bp;GAPDH;上游：5′-CTCCATACGGTATCACACGC-3′;下游：3′-CAGGCATTGGAAGATCGGAC-5′;产物长度为：128 bp。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行实验数据分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示。計量资料采用组间t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理学检测 正常组肝脏切片HE染色可见肝细胞大小均一，细胞核分布均匀，切片表面光滑，没有任何脂肪颗粒浸润，而模型组表面粗糙，弥漫有大量脂肪空泡，同时细胞核受到了明显挤压，与模型组比较，各观察组均有一定好转。见图1。

2.2 小鼠肝功能 与正常比较，模型组肝功能指标AST和ALT均明显升高（P<0.05），各观察组相较于模型组明显降低（P<0.05），此外橙皮苷高剂量组和多烯磷脂酰胆碱组差异无统计学意义。见表1。

2.3 小鼠血脂指标 与正常比较，模型组血脂指标TG和TC均明显升高（P<0.05），各观察组相较于模型组明显降低（P<0.05），此外橙皮苷高剂量组和多烯磷脂酰胆碱组差异无统计学意义。见表2。

2.4 小鼠肝脂指标 与正常比较，模型组肝脂TG和TC均明显升高（P<0.05），各观察组相较于模型组明显降低（P<0.05），此外橙皮苷高剂量组和多烯磷脂酰胆碱组差异无统计学意义。见表3。

2.5 蛋白和mRNA表达的检测 与正常组比较，模型组小鼠肝脏组织中PPARα蛋白及mRNA表达明显降低。而SREBP-1c表达则明显升高（P<0.05），而多烯磷脂酰胆碱组和橙皮苷组相较于模型组PPARα表达则明显升高，而SREBP-1c明显降低（P<0.05），橙皮苷高剂量组和多烯磷脂酰胆碱组则差异无统计学意义（P<0.05）。见图2，表4。

3 讨论

过去的研究认为NAFLD是一种良性病变，一般不会给身体带来较大的损害，但随着医学技术的发展，越来越多的研究结果表明，NAFLD危害极大，其是多种慢性肝脏病变的早期阶段，控制不及时可引发患者发生肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等，此外本病也可引起动脉硬化、冠心病等多种心血管疾病，因此当前NAFLD已经引起国内外众多学者的广泛关注[7-8]。过去的研究认为NAFLD主要由高脂高糖饮食所引起[9]，但是近年来研究发现[10]，人们日常生活中特别是饮料中的高果糖也是本病发生的因素之一，且可能是近年来NAFLD发生率逐年升高的关键。目前国内外对于高果糖饮食动物模型的构建还没有统一定论，文献报道的高果糖饮食所构建的NAFLD模型主要有2种[11-12]，一种为20%～30%的高果糖水日常饮用8～18周，另一种为10%的果糖水溶液+高脂饮食饲养6～12周所构建的NAFLD模型。考虑到日常人们饮食中的习惯，本次研究最终采用了第2种方法构建NAFLD模型，研究结果发现，与正常组比较，模型组小鼠出现明显的肝功能和血脂异常，同时肝脏病理学也呈现出明显的脂肪颗粒浸润，这证明了本研究模型成功构建。

橙皮苷是我国中药陈皮中的主要成分[13]，现代研究发现[14]，其主要存在于柑橘属植物果实中，自身结构为二氢黄酮类化合物。橙皮苷是一种新的维生素并被命名为维生素P，主要功能为保护血管，降低毛细血管通透性，此外也可以延长坏血病患者的生存率[15]。随着生物技术的发展，近年来研究发现[15-16]，橙皮苷具有多种药理活性，常见的如抗氧化和清除有害自由基，此外其还有抗炎、抗病毒以及抗过敏等多种药理活性。关于其对高脂饮食所构建的NAFLD动物模型的治疗也有文献报道，如国内学者蔡莉等[17]采用高脂饲料构建了NAFLD模型，发现橙皮苷可明显降低其肝功能，并分析其作用机制可能是通过调节脂质抗氧化实现的，此外其他学者也进行了相似的研究[18-19]，均证明橙皮苷对脂肪肝并具有很好的作用，但是对高果糖饮食所构建的NAFLD动物模型还没有文献报道，本次采用橙皮苷治疗高果糖高脂饮食所构建的NAFLD动物模型，研究结果发现，与模型组比较，橙皮苷3个观察组均可以明显降低肝功能指标AST、AST，同时降低肝脏和血液中TG和TC的含量，这提示橙皮苷对果糖脂肪肝小鼠肝功能和血脂具有明显的保护作用。

脂肪肝的核心影响因素为脂质代谢，近年来研究发现，脂质代谢不仅可调节脂质代谢本身，其还在抗脂质过氧化以及抑制炎性反应等多方面具有重要的作用，在所有的氧化基因中，PPARα和SREBP-1c与其关系密切[20]。其中SREBP-1c主要调控功能为脂肪酸的合成，其属于维持肝脏脂质稳态的转录调节物，此外近年来研究发现，在中医证候中，其还是多种代谢综合征症候群的调控连接点[21]。PPARα是肝脏中大量表达的一类配体激活核转录因子，其主要功能为调控脂肪酸的氧化、转运以及纸质存储，此外其还可以通过调节线粒体功能，进而调节过氧化物酶体的β氧化、降低炎性反应浸润[22]。本次研究发现，与正常组比较，高果糖水+高脂饲料喂养可明显升高肝组织中SREBP-1c的表达，同时降低PPARα蛋白及mRNA的表达，而橙皮苷则可以明显降低SREBP-1c，升高PPARα表达，此外橙皮苷高剂量组和多烯磷脂酰胆碱组基本一致，这提示，橙皮苷对改善果糖脂肪肝指脂代谢具有很好的作用。

综上所述，本次研究结果表明，10%的高多糖+高脂饲料喂养8周可形成果糖脂肪肝模型，其模型具有明显的肝功能、血脂和肝脂的异常，而橙皮苷则可以明显改善肝功能，降低肝脂和血脂，这与橙皮苷可以调节脂代谢相关基因PPARα和SREBP-1c的表达有关。

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（2019-09-05收稿 责任编辑：王明）

基金项目：湖北省卫生计生委应用基础研究计划面上项目（WX17D32）

作者简介：李晓霞（1984.07—），女，硕士，主治医师，研究方向：消化道动力及肿瘤，E-mail：qwe201908@163.com

通信作者：韩菊平（1970.03—），男，硕士，副主任医师，研究方向：消化道肿瘤及肝胆疾病，E-mail：47736196@qq.com