基于血液代谢组学技术的甲氨蝶呤抗类风湿性关节炎作用机制研究

蔡萧君 李宇 胡杨 吴圆圆 王钦 王旭玲

摘要 目的：采用代謝组学技术探究甲氨蝶呤抗类风湿性关节炎的作用机制。方法：采用佐剂性关节炎（AIA）方法复制大鼠类风湿性关节炎模型，采用经典足肿胀度指标评价模型复制程度，并给予甲氨蝶呤进行治疗。收集血液样本采用代谢轮廓技术表征疾病发生发展及给予药物干预后的代谢水平，采用MSE数据采集模式全成分获取各组大鼠的实验过程中的生物学信息，并通过模式识别、富集分析等手段以整体分析到局部的聚焦分析方法获取与类风湿性关节炎相关的核心代谢酶及血液生物标记物。进而阐明类风湿性关节炎的发病机制及甲氨蝶呤的作用机制。结果：非靶向代谢轮廓分析显示，甲氨蝶呤对类风湿性关节炎大鼠的整体代谢由明显的干预作用，代谢轮廓由模型状态向空白组状态发生偏移，从整体代谢角度证明甲氨蝶呤对类风湿性关节炎鼠有良好的疗效。通过正交偏最小二乘判别分析中的S图聚焦获取类风湿性关节炎大鼠血液相关代谢异常标记物，如鸟苷五磷酸腺苷、葡萄醛酸胆红素、鸟苷二磷酸、硬脂酸等。通路分析显示来发现类风湿性关节炎大鼠主要涉及脂肪酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢、嘧啶代谢、戊糖和葡萄糖醛酸化、嘌呤代谢。结论：甲氨蝶呤对类风湿性关节炎大鼠有良好的治疗作用。通过整体的对脂肪酸生物合成等代谢通路中关键代谢酶及代谢标记物的调节作用可能起到抑制类风湿性关节炎的作用。

关键词 甲氨蝶呤;类风湿性关节炎;非靶向代谢组学;花生四烯酸;生物标记物

Comprehensive Serum Metabolomics Analysis with the Inhibitory Effect

of Methotrexate on Rheumatoid Arthritis Inflammation

CAI Xiaojun，LI Yu，HU Yang，WU Yuanyuan，WANG Qin，WANG Xuling

（Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine Harbin 150036，China）

Abstract Objective：To explore the anti-rheumatoid arthritis mechanism of methotrexate by using metabonomic techniques.Methods：The model of rheumatoid arthritis in rats was replicated by adjuvant arthritis （AIA）.The replication degree of the model was evaluated by classical foot swelling index and treated with methotrexate.Serum samples were collected to characterize the occurrence and development of diseases and the metabolic level after drug intervention by metabolic profiling technology.Biological information of each group of rats was obtained by MSE data acquisition mode during the experiment.Core metabolic enzymes related to rheumatoid arthritis were obtained by pattern recognition，enrichment analysis and other methods.The pathogenesis of rheumatoid arthritis and the action mechanism of methotrexate were further elucidated.Results：Non-targeted metabolic profile analysis showed that methotrexate had an obvious intervention effect on the overall metabolism of rheumatoid arthritis rats，and the metabolic profiles shifted from model state to blank group state.It was proved that methotrexate had a good effect on rheumatoid arthritis rats from the point of view of overall metabolism.The blood-related metabolic abnormality markers such as guanosine Pentaphosphate adenosine，glucuronic acid bilirubin，guanosine diphosphate，stearic acid，in rheumatoid arthritis rats were obtained by S-map focusing in orthogonal partial least squares discriminant analysis.Pathway analysis showed that fatty acid biosynthesis，starch and sucrose metabolism，pyrimidine metabolism，pentose and glucuronidation，purine metabolism were mainly involved in rheumatoid arthritis rats.Conclusion：Methotrexate has a good therapeutic effect on rheumatoid arthritis rats.The regulation of key metabolic enzymes and metabolic markers in metabolic pathways such as fatty acid biosynthesis，starch and sucrose metabolism，pyrimidine metabolism may play a role in inhibiting rheumatoid arthritis.

Keywords Methotrexate; Rheumatoid arthritis; Mon-targeted metabonomics; Arachidonic acid; Biomarkers

中图分类号：R274.9文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.010

类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种慢性全身性炎症性自身免疫性疾病，影响身体不同部位，不可避免地引起关节疼痛、肿胀和功能丧失[1]。RA显著影响生命质量，导致患者严重残疾。目前对类风湿性关节炎患者的常规治疗，包括改善病情抗风湿药和生物制剂，并不令人满意。据我们所知，关于类风湿关节炎的发病机制还没有统一的理论。因此，有必要寻找一种敏感性和特异性较高的早期诊断标志物。

代谢组学是研究疾病与代谢关系的最新方法之一。几种分析技术已被广泛应用于代谢物的测定，包括质谱、磁共振成像氢谱和液相色谱-质谱[2]。值得注意的是，新出现的证据表明RA易感性可能与代谢紊乱有关[3-4]。代谢组学方法可以提供对整个代谢过程的洞察，并确定代谢物和相关代谢途径的差异[5]。最近的证据也表明，代谢组学方法是表征RA代谢变化的有效工具[6-8]。

临床实践中甲氨蝶呤被视为RA的标准一线药物，在60%以上的RA患者中取得了满意的治疗效果[9-12]。然而，这种治疗效果背后的详细机制尚未完全阐明。本研究采用代谢组学技术对其进行研究，并对甲氨蝶呤的体内外治疗效果进行评价。确定了甲氨蝶呤治疗后代谢概况的总体观点，为类风湿性关节炎的发病机制研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

雄性SD大鼠（150±20）g，5～6周龄，清洁级，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，合格证编号：SCXK-（军）2018-004。无菌动物房中饲养，模拟自然光规律给予周期为12 h的光照调节，温度和相对湿度分别为（20±5）℃和（40±5）%。所有大鼠自由给予标准饮食和自来水。

1.1.2 药物

甲氨蝶呤片（通化茂祥制药有限公司，国药准字H22022674）。

1.1.3 试剂与仪器

UPLC-G2Si-HDMS系统（Waters公司，美国，型号：UPLC-MS）;XPE105分析天平（梅特勒-托利多公司，瑞士，型号：XPE105）;RUPT-Ⅲ超纯水机（山东新瑞分析仪器有限公司，型号：RUPT-Ⅲ）;YLS-7A型足跖容积测量仪（安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司，型号：YLS-7A）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

大鼠实验前适应性喂养7 d后，按照体质量随机分为空白组、模型组和给药组，每组8只。模型组和给药组大鼠足跖皮内注射弗氏完全佐剂0.1 mL（连续2 d），诱导类风湿性关节炎。空白组大鼠足跖皮内注射生理盐水0.1 mL。造模第14天后测定足跖肿胀度。

1.2.2 给药方法

将甲氨蝶呤片剂研碎并均匀混悬于0.5% CMC-Na，浓度0.1 mg/mL[13]。实验第15天给药组大鼠灌胃给予甲氨蝶呤溶液（1 mL/100 g），连续7 d，空白组和模型组灌胃等量的生理盐水。

1.2.3 检测指标与方法

检查各组大鼠的一般形态学及足肿胀程度。

1.2.3.1 一般形态学观察与代谢样本的制备 实验期间观察各组大鼠的一般形态学，如精神状态、活动情况、皮毛、饮食等。实验第22天，采用主动脉取血方法采集各组大鼠血液，离心（4 ℃，3 500 r/min，10 min，离心半径13.5 cm）得血清，于-80 ℃保存。临用时，取100 μL血清，置于1.5 mL离心管中，加入100 μL的甲醇，涡旋30 s，离心（4 ℃，10 000 r/min，15 min，离心半径13.5 cm）得上清液，35 ℃下氮气吹干，100 μL甲醇复溶，再次离心（4 ℃，10 000 r/min，15 min，离心半径13.5 cm），用0.22 μm微孔滤膜滤过，取上清液即得代谢样本。

1.2.3.2 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLCTM C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流动相A：0.1%乙腈、流动相B：0.1%甲酸水，梯度洗脱;柱温：40 ℃;流速：0.3 mL/min;进样量：3 μL。血液梯度洗脱方法见表1。

1.3 统计学方法

采用组学分析平台MetaboAnalyst对血液代谢物组数据进行预处理。采用Ezinfo 2.0（瑞典Umetrics公司）进行化学计量学分析，最后通过偏正交最小二乘判别分析筛选类风湿性关节炎大鼠血液生物标记物。以t检验方法考察空白组、模型组间的各项统计学差异结果，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般形态学结果

空白组大鼠精神状态较好，活动规律正常、行动自如、皮毛光滑圆润，进食和饮水在实验整体阶段都无异常。造模第14天，与空白组比较，模型组大鼠精神萎靡、活动不便、部分大鼠出现后肢瘫痪现象、需要依靠前肢进行移动、毛色枯黄、瘦弱，后肢出现明显的关节红肿和变性状态，生命状态极差。

2.2 足肿胀程度结果

实验第1天，各组大鼠足肿胀程度相似，差异无统计学意义。造模后，即实验第14天，模型组和给药组大鼠出现明显的足肿胀现象，差异有统计学意义（P<0.05）。即证明类风湿性关节炎模型复制成功。见表2。

2.3 代谢组学分析

各組大鼠血液代谢指纹如图1所示，差异无统计学意义你，通过将维度处理，得到显示组间差异最大的二维图谱。见图2。代谢轮廓的得分图显示3组件分布明显，其中给药组处于空白组和模型组间，证明给予甲氨蝶呤后，疾病状态下的大鼠的整体代谢水平有一定程度的好转趋势，整体代谢向空白组靠拢。

為达到仪器和数据的可靠性，本研究采用QC样本（质控样本）在数据采集各个阶段进行监督，并显示与主成分分析中。

进一步对空白组和模型组的生物样本进行正交偏最小二乘判别分析分析，得到对分组贡献明显的差异标记物。见图3。共鉴定出12个与类风湿性关节炎大鼠血液生物标记物。见表3。

生物标记物含量变化如图5所示，可以看到通过甲氨蝶呤治疗后，各生物标记物都向正常状态回调。通路富集结果显示类风湿性关节炎大鼠的代谢主要涉及脂肪酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢、嘧啶代谢、戊糖和葡萄糖醛酸化、嘌呤代谢。见图6。最后通过Metscape软件构建代谢通路示意图。见图7。

2.4 生物标记物鉴定

生物标记物的结构鉴定是代谢组学的重点和难点，本部分直接采用以标准品建立质谱库的人类代谢组数据库HMDB进行匹配鉴定。根据记载的不同碰撞能下碎片信息进行比对，作为生物标记物的判定依据，以LysoPE（0∶0/24∶0）的鉴定结果为例。见图4。

3 讨论

尿苷三磷酸是合成RNA的主要原料之一。据报道，尿苷三磷酸和维生素B12的联合应用对压迫性神经痛具有显著治疗效果。与单独服用维生素B12比较，尿苷三磷酸和维生素B12联合服用对无严重不良事件患者的疼痛缓解方面具有更显著的统计优势[14]，骨髓基质细胞脂肪生成失调和成骨可能会导致骨质疏松症。在激活p2y2受体后，尿苷三磷酸可通过调节骨髓基质细胞的成骨和成脂分化来延缓骨质疏松症的进展[15]。因此，模型组中尿苷三磷酸的失调可能导致骨关节病。近年来有一系列相关研究结果证明甲氨蝶呤对尿苷三磷酸的代谢发挥调控作用，同时甲氨蝶呤对骨损伤有一定程度的保护作用，通过2方面的协同起效，最终达到治疗类风湿性关节炎的目的[16]。

维生素D3-23羧酸是维生素D的活性形式，具有增加钙磷吸收、促进生长和骨钙化、维持血液中柠檬酸盐正常水平、防止肾代谢中氨基酸丢失等生理功能[17]。对烟曲霉抗原的免疫反应可引起过敏性疾病，即过敏性支气管肺曲霉病，同时增加CD4+T细胞中白细胞介素-13反应。能抑制这种过敏反应，改善过敏性支气管肺曲霉病患者的病情[18]。另外，其具有免疫调节和抗炎活性。研究表明，维生素D3-23羧酸在许多自身免疫疾病如类风湿性关节炎、多发性硬化和骨质疏松症的进展中起着关键作用[19]。许多研究表明，缺乏阳光和维生素D3-23羧酸会导致硬化和骨质疏松症;因此，补充维生素D3-23羧酸对骨质疏松症患者是非常有效的治疗方法[20]。骨质疏松症与动脉粥样硬化高度相关。这2种疾病的并行进展增加了冠状动脉和骨折的风险。维生素D3-23羧酸缺乏可大大增加骨折风险，并导致继发性甲状旁腺功能亢进和冠状动脉钙化[21-22]。镁中钙质酸含量显著增加，说明维生素D3-23羧酸含量降低，降低了免疫系统的调节能力。近年来，研究发现作为白血病的靶向性药物甲氨蝶呤在治疗过程中对维生素有很好的调节作用[23]，后者在骨生长和发育都有重要作用。由此推断甲氨蝶呤在类风湿性关节炎患者治疗过程中起到对维生素调节的作用。

二十二碳六烯酸（DHA）是人体必需的多不饱和脂肪酸。DHA具有多种生物学活性，如帮助脑细胞发育、延缓衰老、改善血液循环和降低血脂。此外，二十二碳六烯酸还可以预防风湿性关节炎。据报道，DHA能抑制骨髓源性巨噬细胞的增殖和分化，诱导成熟破骨细胞的凋亡。最终，DHA导致骨吸收细胞数量减少。DHA可以通过生物衍生作用生成一种新型的生物活性脂质递质。这些内源性递质可以作用于特定的G蛋白偶联受体以抑制炎性反应。模型组中的DHA含量显著增加，表明人体对RA引起的炎性反应有应激反应，给予甲氨蝶呤治疗后二十二碳六烯酸含量成回调趋势，证明甲氨蝶呤对二十二碳六烯酸有一定程度的调节作用，近年来研究表明甲氨蝶呤可能通过对G-Protein受体120的调节达到调节DHA目的[24]。

本研究利用非靶向代谢组学分析样本中所有可测量的分子，包括化学未知物。但是，用非靶向代谢组学进行量化的能力极为有限，需要我们对甲氨蝶呤治疗的类风湿关节炎患者进行靶向研究。此外，作为一种经典的化学治疗药物，抑制潜在靶点后的未知不良反应还需要我们进一步评价。

参考文献

[1]Sfriso P，Punzi L，Ianniello A，et al.Clinical，radiological and laboratory aspects of rheumatoid arthritis associated with high serum levels of IgA[J].Clinical & Experimental Rheumatology，1994，12（6）：690.

[2]Williams R，Lenz E M，Wilson.A J，et al.A multi-analytical platform approach to the metabonomic analysis of plasma from normal and zucker（fa/fa）obese rats[J].Molecular BioSystems，2006，2（3-4）：174.

[3]Toms T E，Panoulas V F，Smith J P，et al.Rheumatoid arthritis susceptibility genes associate with lipid levels in patients with rheumatoid arthritis[J].Annals of the Rheumatic Diseases，2011，70（6）：1025-1032.

[4]Kawashiri S Y，Kawakami A，Yamasaki S，et al.Effects of the anti-interleukin-6 receptor antibody，tocilizumab，on serum lipid levels in patients with rheumatoid arthritis[J].Rheumatology International，2011，31（4）：451-456.

[5]Nicholson J K，Wilson I D.Opinion：Understanding ＼"Global＼" Systems Biology：Metabonomics and the Continuum of Metabolism[J].Nature Reviews Drug Discovery，2003，2（8）：668-676.

[6]Madsen R K，Torbjrn Lundstedt，Gabrielsson J，et al.Diagnostic properties of metabolic perturbations in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Research & Therapy，2011，13（1）：R19.

[7]Wenjun S，Yunfan Y，Siran Z，et al.Studies on Anti-inflammatory Effect and Analgesic Effect of Silkworm Shit[J].Asia-Pacific Traditional Medicine，2013，9（9）：44-46.

[8]Malemud C，Reddy S.Targeting Cytokines，Chemokines and Adhesion Molecules in Rheumatoid Arthritis[J].Current Rheumatology Reviews，2008，4（4）：219-234.

[9]Van Walsem A，Pandhi S，Nixon R M，et al.Relative benefit-risk comparing diclofenac to other traditional non-steroidal anti-inflammatory drugs and cyclooxygenase-2 inhibitors in patients with osteoarthritis or rheumatoid arthritis：a network meta-analysis[J].Arthritis Research & Therapy，2015，17（1）：1-18.

[10]Huffman K M，Jessee R，Andonian B，et al.Molecular alterations in skeletal muscle in rheumatoid arthritis are related to disease activity，physical inactivity，and disability[J].Arthritis Research & Therapy，2017，19（1）：1-17.

[11]Huang Z，Tong H F，Li Y，et al.Effect of the Polymorphism of Folylpolyglutamate Synthetase on Treatment of High-Dose Methotrexate in Pediatric Patients with Acute Lymphocytic Leukemia[J].Medical Science Monitor International Medical Journal of Experimental & Clinical Research，2016，22：4967-4971.

[12]Pang Z，Wang G，Ran N，et al.Inhibitory Effect of Methotrexate on Rheumatoid Arthritis Inflammation and Comprehensive Metabolomics Analysis Using Ultra-Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time of Flight-Mass Spectrometry（UPLC-Q/TOF-MS）[J].International Journal of Molecular Sciences，2018，19（10）：1-23.

[13]Miceli-Richard C，Gestermann N，Corinne Amiel.Effect of methotrexate and anti-TNF on Epstein-Barr virus T-cell response and viral load in patients with rheumatoid arthritis or spondylarthropathies[J].Arthritis Research & Therapy，2009，11（3）：1-9.

[14]Schett，Georg.Review：Immune cells and mediators of inflammatory arthritis[J].Autoimmunity，2008，41（3）：224-229.

[15]Tao H X，Xiong W，Zhao G D，et al.Discrimination of three Siegesbeckiae Herba species using UPLC-QTOF/MS-based metabolomics approach[J].Food and Chemical Toxicology，2018，119：400-406.

[16]King T J，Shandala T，Lee A M，et al.Potential Effects of Phytoestrogen Genistein in Modulating Acute Methotrexate Chemotherapy-Induced Osteoclastogenesis and Bone Damage in Rats[J].International Journal of Molecular Sciences，2015，16（8）：18293-18311.

[17]Yongeun K，Gromovsky A D，Mark B J，et al.Gamma-tocotrienol attenuates the aberrant lipid mediator production in NLRP3 inflammasome-stimulated macrophages[J].The Journal of Nutritional Biochemistry，2018，58：169-177.

[18]Camandola S，Leonarduzzi G，Musso T，et al.Nuclear Factor kB Is Activated by Arachidonic Acid but Not by Eicosapentaenoic Acid[J].Biochem Biophys Res Commun，2016，229（2）：643-647.

[19]Wen H，Gris D，Lei Y，et al.Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling[J].Nature Immunology，2011，12（5）：408-415.

[20]Morisseau C，Hammock B D.Impact of Soluble Epoxide Hydrolase and Epoxyeicosanoids on Human Health[J].Annual Review of Pharmacology and Toxicology，2013，53（1）：37-58.

[21]Maternal high-fat diet-induced programing of gut taste receptor and inflammatory gene expression in rat offspring is ameliorated by CLA supplementation[J].Physiological Reports，2015，3（10）：e12588.

[22]Maceyka M，Spiegel S.Sphingolipid metabolites in inflammatory disease[J].Nature，2014，510（7503）：58-67.

[23]Xiye W，Dan L，Mingyang J，et al.Nearest Neighbor Algorithm Coupled with Metabonomics to Study the Therapeutic Mechanism of Sendeng-4 in Adjuvant-Induced Rheumatoid Arthritis Rat[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2018，2018：1-9.

[24]Shin J I，Jeon Y J，Lee S，et al.G-Protein-Coupled Receptor 120 Mediates DHA Induced Apoptosis by Regulating IP3R，ROS and，ER Stress Levels in Cisplatin-Resistant Cancer Cells[J].Molecules and cells，2019，42（3）：252-261.

（2019-10-16收稿 責任编辑：徐颖）

基金项目：黑龙江省自然科学基金面上项目（H2017043）

通信作者：蔡萧君（1975.12—），男，博士，主任医师，研究方向：神经精神的基础研究，内分泌代谢病药物研究，E-mail：ssycxj@163.com