慢性乙型肝炎干扰素治疗与KIR基因多态性及干扰素抗体的相关性研究

王慧　林栋栋　李长缨　柳富会

【摘要】 目的：為观察KIR基因对干扰素疗效的作用及其与干扰素抗体产生的相关性，将慢性乙型肝炎干扰素治疗的患者进行KIR基因多态性、血清干扰素抗体进行综合分析。方法：随机选取应用干扰素治疗的慢乙肝患者60例，检测KIR基因分型、相关生化免疫指标及HBV-DNA载量以及干扰素抗体。根据研究对象对干扰素的治疗情况，将其分为治疗有效组和治疗无效组，将两组患者的KIR分型结果进行统计学处理；另外根据是否产生干扰素抗体，将研究对象分为抗体生成组和非抗体生成组，并分别对KIR分型的结果及其疗效进行统计学处理，分析两组KIR分型的差异性及对干扰素治疗效果的影响。结果：（1）在60例研究对象中共检出17种KIR基因的24个等位基因，其中假基因3DP、框架基因2DL4、3DL2、3DL3在两组研究对象中出现的频率为100%，KIR2DL2*001-005、2DS2*001-005、3DP1*001/002/004、2DL5等位基因在干扰素治疗有效组表达频率明显高于治疗无效组，KIR2DS4*003-007等位基因在治疗有效组频率明显低于治疗无效组，差异均有统计学意义（P<0.05），其他等位基因分布比较，差异无统计学意义（P>0.05）。（2）60例研究对象治疗后血清抗-干扰素抗体阳性者有8例（13.33%），其中包括治疗有效组6例（20.00%），治疗无效组2例（6.67%），差异无统计学意义（P=0.254）。（3）2DL5B*002/004/007、3DL1*001-009/015-020及3DP1*003与干扰素抗体的产生均有相关性（P<0.05）。结论：（1）可能同慢乙肝患者干扰素应答有关的KIR基因有：KIR2DL2*001-005、2DS2*001-005、3DP1*001/002/004、2DL5，可能同干扰素治疗无效有关的KIR基因为KIR2DS4*003-007。（2）抗干扰素抗体对干扰素疗效影响较小，且阳性率较低。（3）KIR基因型中可能与抗-干扰素抗体产生有关的包括：2DL5B*002/004/007、3DL1*001-009/015-020及3DP1*003。

【关键词】 慢性乙型肝炎； KIR基因； 杀伤细胞免疫球蛋白样受体； 干扰素抗体

Study on the Correlation between KIR Gene Polymorphism and Interferon Antibody in Patients with Chronic Hepatitis B/WANG Hui，LIN Dong-dong，LI Chang-ying，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（06）：020-024

【Abstract】 Objective：In order to observe the effect of KIR gene on the therapeutic effect of interferon and its correlation with the production of interferon antibody，to analyze the KIR gene polymorphism and serum interferon antibody.Method：60 cases of chronic HBV infection were randomly selected，and the KIR genotype was detected，the interferon antibody，the HBV-DNA carrier rate and the related immunological indexes and biochemical tests were performed.According to the response to interferon therapy，the test objects were divided into effective treatment group and ineffective treatment group，two groups of KIR typing results were analyzed；the other according to interferon antibody production or not，the test objects were divided into antibody group and non antibody group，and the type of KIR effect and the results of the two groups were statistically differences，analysis of the impact of the antibody on the efficacy of two groups and KIR typing results.Result：（1）In 60 subjects were detected in the 17 KIR genes and 24 alleles，including false gene 3DP，gene 2DL4，3DL2 framework and 3DL3 in two groups of subjects in the frequency was 100%，the KIR2DL2*001-005，2DS2*001-005，3DP1*001/002/004，2DL5 allele in treatment effective group were significantly higher than those in ineffective treatment group，the frequency of KIR2DS4*003-007 allele in the effective treatment group was significantly lower than that in ineffective treatment group，the differences were statistically significant（P<0.05），there was no significant difference in the distribution of other alleles（P>0.05）.（2）60 patients with after treatment，there were 8 cases（13.33%）with positive anti interferon antibody，including the treatment of effective group of 6 cases（20.00%），2 cases in ineffective treatment group，the difference was not statistically significant（P=0.254）.（3）2DL5B*002/004/007，3DL1*001-009/015-020 and 3DP1*003 were correlated with the production of interferon antibody （P<0.05）.Conclusion：（1）KIR genes may associated with the response to interferon in patients with chronic hepatitis B：KIR2DL2*001-005，2DS2*001-005，3DP1*001/002/004，2DL5，KIR may be associated with interferon therapy ineffective：KIR2DS4*003-007.（2）Anti interferon antibody has little effect on interferon， and the positive rate is low.（3）KIR genotype may be related to anti interferon antibody production：2DL5B*002/004/007， 3DL1*001-009/015-020 and 3DP1*003.

【Key words】 Chronic hepatitis B； KIR gene； Killer cell immunoglobulin like receptor； Interferon antibody

First-authors address：Qingdao NO.6 Peoples Hospital，Qingdao 266033，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.06.006

慢性乙型肝炎在我国为严重的病毒性传染病，发病率居高不下，目前对此类患者的治疗主要是抗病毒药物的治疗，其药物包括干扰素及核苷（酸）类物[1]，慢乙肝患者对抗病毒治疗的效果不一，原因除病毒方面影响外，宿主的种族、遗传因素及免疫状况均对其产生较大影响[2-5]。目前研究发现慢乙肝患者对干扰素的不同应答水平是与其个体的遗传因素特别是人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）相关基因及其他一些重要基因多态性有关[6]。KIR与HLA有着密切的关联[7]，本研究目的在于探寻可能同干扰素治疗相关的KIR基因，对临床治疗和预后判断具有一定意义。另外干扰素抗体是否对干扰素治疗效果有影响，且抗体的产生是否与机体自身的免疫基因有内在关系，目前尚无结论。本研究拟综合分析慢乙肝干扰素治疗的患者KIR基因多态性、血清干扰素抗体之间的关系，可根据患者的基因特点，合理化、个体化用药，因此该研究结果具有重要的理论和实践意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究中的60例患者均为在青岛市传染病医院就诊的接受干扰素治疗的慢性乙型肝炎患者。入选标准：60例患者诊断均明确，符合2000年西安会议制定的《病毒性肝炎诊断标准》[8]，并排除其他嗜肝病毒感染、自免肝、药物性肝炎及核苷类抗病毒药物使用史者。（1）根据干扰素疗效将入选患者分为两组，干扰素治疗有效组（n=30）：HBV-DNA病毒载量较前下降≥2 log；肝功恢复正常；HBeAg滴度下降，部分患者出现HBeAb。干扰素治疗无效组（n=30）：HBV-DNA病毒载量较前下降<2 log或未下降；肝功未能恢复正常；HBeAg滴度未下降或未阴转。（2）根据干扰素抗体产生与否将入选患者分为两组，干扰素抗体生成组：经干扰素治疗后血清抗-干扰素抗体阳性者。干扰素抗体未生成组：经干扰素治疗后血清抗-干扰素抗体阴性者。该研究已经伦理学委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 标本的采集 采集研究对象外周静脉血，清晨空腹，肘静脉穿刺，抽取外周静脉全血5 mL，应用EDTA抗凝及血清3 mL，-70 ℃保存备用。

1.3 研究方法

1.3.1 基因组DNA的提取 采用美国戴诺生物有限公司提供的试剂盒，按说明书进行测定。

1.3.2 检测KIR基因型 应用序列特异性PCR（sequence specific primer polymerase chain reaction，PCR/SSP），采用序列特异性引物聚合酶链反应法（SSP-PCR）。应用KIR基因分型试剂盒（DYNAL公司，批号：003），分别检测KIR2DL1*-5*；2DS1*-5*；3DL1*-3*；3DS1*；2DP1*；3DP1*等位基因。按照说明书进行扩增程序。

1.3.3 干扰素抗体的检测 采用人干扰素抗体（anti-IFN）酶联免疫检测试剂盒（美国R&D公司）测定样品中是否产生人干扰素抗体。

1.3.4 肝功能的检测 所用试剂盒由上海科华东菱诊断用品有限公司生产，应用OLYMPUS AU400全自动生化分析仪检测。

1.3.5 乙肝病毒的相关检测 HBV标志物（HBsAg、HBsAb、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc）：应用上海实业科华生物技术有限公司生产的乙肝五项酶免疫试剂盒，按试剂盒说明书进行操作。HBV-DNA：应用light cycler PCR仪（美国罗氏公司生产），HBV核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒（深圳市匹基生物工程股份有限公司生产）按照说明书所检测。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，采用四格表 字2检验及相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组KIR等位基因的分布情况比较 在本研究中，对60例研究对象共检测了包括17种KIR基因的24个等位基因，其中框架基因2DL4、3DL2、3DL3及假基因3DP1在所有研究对象中均被检测到。在干扰素治疗有效组检测到所有KIR等位基因型别。但是在干扰素治疗无效组中未检测到KIR2DL5B*002/004/007、2DL5B*003、3DP1*001-004、3DP1*001/002/004；而可检测到KIR2DP1*00101-00102、2DL1*001-006、2DL3*001-006、3DP1*003为阳性。干扰素有效组KIR2DL2*001-005、2DS2*001-005、3DP1*001/002/004、2DL5等位基因的阳性率分别为20.00%、20.00%、20.00%、56.67%，均高于干扰素治疗无效组的1.11%、0、0、30.07%，差异均有统计学意义（P=0.035、0.024、0.024、0.037），KIR2DS4*003-007等位基因的阳性率为36.67%，较干扰素治疗无效组的63.33%明显降低，差异有统计學意义（P=0.039）；两组的其他KIR基因位点检测频率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 活化性及抑制性KIR基因分布 所有研究对象中，抑制性基因的检出率均高于或等于相应的活化性基因的检出率。KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5、3DL1的检出率分别高于或等于相应的KIR2DS1、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5、3DS1的检测率。

2.3 干扰素抗体产生与干扰素治疗效果的关系 治疗后60例患者中抗-干扰素抗体阳性为8例，其中治疗有效组为6例（20.00%），治疗无效组为

2.4 干扰素抗体与KIR基因型之间的关系 2DL5B*002/004/007、3DL1*001-009/015-020及3DP1*003与干扰素抗体的产生均有相关性（P<0.05），其余KIR基因型与干扰素抗体产生均无关（P>0.05），见表3。

3 讨论

3.1 慢性乙型肝炎的抗病毒治疗 目前对于慢性乙型肝炎最根本的治疗方法为抗病毒治疗，抗病毒治疗特点为：难治性、可治性、长期性，抗乙肝的药物包括核苷（酸）类似物及干扰素。其中应用干扰素治疗是慢性乙型肝炎患者重要的治疗手段，其治疗方式为免疫调节和抗病毒双重作用同时来抑制乙肝病毒的复制。干扰素治疗效果与患者感染时的免疫状态关系密切，适合应用干扰素的指征为：HBeAg阳性，肝功能异常ALT水平在ULN 2.5～10倍，但干扰素治疗慢性乙型肝炎持续免疫应答率仍较低。其影响因素较多，目前研究认为影响因素包括：乙肝病毒的基因型多态性[2-3]、遗传因素特别是HLA相关基因[4]及环境因素等，以及它们之间的相互作用[9-12]，KIR同HLA密切相关，不同患者KIR基因的差异性及多态性研究可以得到与干扰素治疗效果相关的基因，并可对慢乙肝患者的干扰素治疗及预后判断有一定意义。

3.2 KIR与临床疾病的相关研究 目前在疾病相关性研究方面，主要涉及自身免疫性疾病，肿瘤以及某些病毒感染性疾病如HIV、CMV等。奚敏等[13]在CHB干扰素治疗效果与HLA-等位基因的关系研究发现，HLA-DRB1*04同干擾素-α治疗无应答呈正相关，而HLA-DQA1*0505、HLA-DQB1*0301与其呈负相关。Lu等[14]对中国济南地区汉族人群研究发现，KIR2DS2和KIR2DS3可能是乙型肝炎的易感基因，引起肝组织的损伤。KIR2DS1、KIR3DS1和KIR2DL5可能有助于机体清除乙肝病毒。然而目前在国内，尚未有研究KIR与干扰素应答水平关系的。

在本次试验中共研究了24个KIR等位基因在CHB干扰素治疗有效组与无效组的分布，其中干扰素治疗有效组的KIR2DL2*001-005、2DS2*001-005、3DP1*001/002/004、2DL5等位基因的阳性率均显著高于干扰素治疗无效组（P<0.05），而KIR2DS4003-007等位基因在干扰素治疗无效组的表达频率高于干扰素治疗有效组（P<0.05）。这提示KIR2DL2*001-005、2DS2*001-005、3DP1*001/002/004、2DL5等位基因可能是CHB干扰素治疗效果的预测因素，KIR2DS4003-007等位基因则可能是CHB干扰素无效的预测因素，这与李长缨等[15]对青岛地区汉人的研究结论相同。

3.3 干扰素抗体的相关研究

3.3.1 干扰素抗体与病毒性肝炎 目前对于干扰素抗体与慢性乙型肝炎患者应用干扰素治疗的效果之间有无关系尚无定论。毛乾国等[16]研究指出，干扰素具有一定的免疫原性，能刺激机体产生抗体，表明α-干扰素治疗慢性乙型肝炎时，干扰素中和抗体的产生能明显减轻患者干扰素的疗效。熊玉卿等[17]在研究中发现慢性HBV感染患者在应用干扰素治疗后，未产生干扰素抗体的患者肝功能能很快恢复正常，而产生干扰素抗体的患者肝功能好转不明显，两者差异有统计学意义（P<0.05）。Lok等[18]的研究表明，干扰素中和抗体的产生可导致患者应用干扰素治疗时的HBV-DNA的阴转率明显下降。

Craxi等[19]则认为干扰素抗体产生与否并未影响干扰素的抗病毒活性。刘国珍等[20]研究证明，干扰素的免疫原性较弱，应用干扰素治疗后机体产生干扰素抗体的机率较低，即使产生抗体，其水平也较低。这些研究表明干扰素在慢性乙型肝炎治疗中仍是重要有效的药物。

本研究60例慢性乙型肝炎患者在经过干扰素治疗后，产生干扰素抗体的为8例，表明其阳性率低。其中干扰素治疗有效组6例（20.00%），干扰素治疗无效组2例（6.67%），差异无统计学意义（P=0.254），提示抗干扰素抗体阳性对干扰素治疗疗效影响较小。

3.3.2 干扰素抗体与KIR基因型之间的关系 目前对于干扰素抗体与KIR基因型关系的相关研究甚少，本研究表明2DL5B*002/004/007、3DL1*001-009/015-020及3DP1*003与干扰素抗体的产生均有相关性（P<0.05），提示这些基因可能同干扰素抗体的产生可能有影响。

参考文献

[1]张琴，巫善明.2009年EASL慢性乙型肝炎治疗临床指南（欧洲肝病研究学会）[J].世界感染杂志，2009，9（5-6）：237-245.

[2] Wai C T，Chu C J，Hussain M，et al.HBV genotype B is associated with better response to interferon therapy in HBeAg（+） chronic hepatitis than genotype C[J].Hepatology，2002，36（6）：1425-1430.

[3] Erhardt A.Response to interferon alfa is hepatitis B virus genotype dependent：genotype A is more sensitive to interferon than genotype D[J].Gut，2005，54（7）：1009-1013.

[4] Chu C J，Lok A S.Clinical significance of hepatitis B genotypes and the response to interferon therapy[J].J Hepatol，2000，33（6）：998-1002.

[5] Dupont B，Selvakumar A，Steffens U.The killer cell inhibitory receptor genomic region on human chromosome 19q13.4[J].Tissue Antigens，1997，49（6）：557.

[6] Martin M P，Gao X，Lee J H，et al.Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS[J].Nature Genetics，2002， 31（4）：429-434.

[7] Selvakumar A，Steffens U，Dupont B.NK cell receptor gene of the KIR family with two IG domains but highest homology to KIR receptors with three IG domains[J].Tissue Antigens， 1996， 48（4 Pt 1）：285-294.

[8]中华医学会传染病与寄生虫病学分会，肝病学分会联合修订.病毒性肝炎防治方案[J].中华传染病杂志，2001，19（1）：55-61.

[9] Thursz M.Genetic susceptibility in chronic viral hepatitis[J].Antiviral Res，2001，52（2）：113-116.

[10]张礼周，张振华，张亚飞，等.程序性细胞凋亡基因单核苷酸多态性与慢性乙型肝炎患者干扰素早期病毒学应答的相关性[J].中华传染病杂志，2011，29（4）：221-225.

[11]李长缨，胡彬，周蓉蓉，等.慢性HBV感染者干扰素治疗应答与KIR基因型相关性研究[J].中国输血杂志，2011，24（7）：571-574.

[12]李家斌，李旭，余鑫之，等.干扰素抗体对慢性乙型肝炎干扰素治疗的影响[J].临床荟萃，1999，14（10）：443-444.

[13]奚敏，臧国庆，冯明亮，等.慢性乙型肝炎干扰素疗效与人类白细胞抗原-等位基因的关系[J].中华传染病杂志，2004，22（4）：242-245.

[14] Lu Zhi-ming，Jiao Yu-lian，F Zhao-lei，et al.Polymorphisms of killer cell immunoglobulin-like receptor gene：possible association with susceptibility to or clearance of hepatitis B virus infection in Chinese Han population[J].Croatian Medical Journal，2008，48（6）：800-806.

[15]李长缨，胡彬，王同显，等.青岛地区汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性研究[J].中华输血杂志，2008，7（21）：506-508.

[16]毛乾国，骆抗志，刘定立，等.干扰素中和抗体对慢性乙型肝炎抗病毒应答的影响[J].中华肝脏病杂志，2004，12（4）：205-207.

[17]熊玉卿，傅军.干扰素抗体对干扰素治疗乙型肝炎疗效的影响[J].中国临床药理学与治疗学，2001，6（1）：70.

[18] Lok A S，Lai C L，Leung E K.Interferon antibodies may negate the antiviral effects of recombinant α-interferon treatment in patients with chronic hepatitis B virus infection[J].Hepatology，1990，12（6）：1266.

[19] Craxi A，Di M V，Volpes R，et al.Anti-alpha interferon antibodies after alpha interferon treatment in patients with chronic viral hepatitis[J].Hepatogastroenterology，1988，35（6）：304-305.

[20]劉国珍，胡国玲，谭德明，等.干扰素中和抗体对干扰素疗效的影响[J].中华产染病杂志，1997，15（4）：197-199.

（收稿日期：2016-10-12） （本文编辑：张爽）