HPLC法同时检测大鼠血浆中3种细胞色素P450探针药物*

李天英，石 迪，郑 岩，郑春宇，李秋红

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040）

细胞色素P450是药物在体内代谢最重要的酶系，包括多种具有不同专属性底物的同工酶，对许多内源性和外源性化合物的代谢起着重要作用[1]。临床上经肝脏代谢的药物有90%以上是由CYP450催化的，其中CYP2E1、CYP2C9和CYP3A4同工酶参与代谢近60%的药物，是药物代谢以及毒理学研究的重要指标[2]。抑制或诱导任何一种CYP450同工酶就会改变另一种或几种药物的代谢特征，从而发生药物间相互作用，尤其是通过同一种酶代谢的药物在临床联合应用时，极易影响疗效引起不良反应[3]。鉴于CYP450酶的活性可影响药物代谢速率和代谢过程，国内外均把药物对CYP450的调控作为药物联合应用的客观指标和参考依据[4,5]。Cocktail探针药物法是通过考察特异性探针药物血药浓度的变化，从而有效评价多种代谢酶亚型的活性，对于有多重代谢途径的剂量设计有重要意义，被认为是一种研究药物相互作用特殊的分析工具[6]。本实验建立了同时测定大鼠血浆中3种同工酶探针药物浓度的HPLC方法，为研究药物相互作用提供有效的分析手段。

1 实验材料

1.1 药品与试剂

氯唑沙宗原料药（批号20110701，大连美仑生物技术有限公司）；甲苯磺丁脲原料药（批号20110501，大连美仑生物技术有限公司）；咪达唑仑注射液（批号20120302，江苏恩华药业股份有限公司）；色谱甲醇（Dikma试剂公司）。

1.2 实验仪器

LC-2010A高效液相色谱仪（日本岛津）；TDL-60B型低速台式离心机（上海荣泰生化工程有限公司）；旋涡QT-1型混合器（上海琪特分析仪器有限公司）；TCL16M型高速冷冻离心机（北京众益中和生物技术有限公司）。

1.3 实验动物

SD大鼠，雌雄各半，体重（180±220）g，购于黑龙江中医药大学实验动物中心，合格证号SCXK（黑）2008004。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Topsil TM C18column（250mm×4.6mm,5μm）；流动相为甲醇-（NH4）2HPO4（54∶46，pH值为3.4）；紫外检测波长为230nm；流速：l.0mL·min-1；柱温：30℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 磷酸氢二铵缓冲溶液的制备 精密称取（NH4）2HPO42.64g，以400mL双蒸水溶解，加85%H3PO41.4mL，调pH值至3.4。

2.2.2 内标液的配制 精密称取地西泮10mg，用甲醇溶解并定容至10mL的量瓶中，得lmg·mL-1内标储备液。精密移取地西泮溶液40μL，加入10mL容量瓶中，甲醇定容，得到4μg·mL-1内标液。

2.2.3 探针药物溶液的配制 氯唑沙宗、甲苯磺丁脲以甲醇作为溶剂，咪达唑仑用水溶解，分别制备浓度为lmg·mL-1的氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑的储备溶液。以水为溶剂稀释各探针药物的储备液，氯唑沙宗和甲苯磺丁脲稀释成浓度为50,20,10,2,1,0.2μg·mL-1的工作液，咪达唑仑稀释成浓度为50,30,10,2,0.5,0.1μg·mL-1的工作液。所有溶液置4℃冰箱中保存。

2.3 血浆样品处理

精密吸取200μL大鼠血浆，加入100μL浓度为4μg·mL-1地西泮溶液作为内标，混匀，再加入氯仿2mL，混悬振荡5min，离心（3500r·min-1，10min），取有机相1.8mL，N2吹干。残渣用流动相100μL溶解，离心（4000r·min-1，5min），取上清液，进样20μL。

2.4 方法专属性考察

在上述色谱条件下，按照上述方法操作。结果见图1。图1A为空白血浆，图1B为含氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、咪达唑仑及地西泮对照品的空白血浆，图1C为大鼠静脉注射给予探针药物后血浆样品。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

图1 结果表明，内源性成分对待测物和内标无干扰。

2.5 线性范围和检测限

分别精密量取不同浓度的氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑混合工作液100μL，加入地西泮内标溶液100μL，N2下吹干，加入大鼠空白血浆200μL，使制备的血浆浓度分别为氯唑沙宗和甲苯磺丁脲50,20,10,2,1,0.2μg·mL-1；咪达唑仑50,30,10,2,0.5,0.1μg·mL-1。按2.3项下的方法处理并测定。探针药物峰面积与内标峰面积之比Y为纵坐标，以血药浓度X为横坐标进行线性回归，3种探针药物的回归方程见表1。线性范围分别为：氯唑沙宗和甲苯磺丁脲0.2～50μg·mL-1；咪达唑仑0.1～50μg·mL-1，最低定量限氯唑沙宗和甲苯磺丁脲均为0.2μg·mL-1，咪达唑仑0.1μg·mL-1。

表1 血浆中各探针药物的标准曲线数据Tab.1 Data of standard curve of probe drugs in plasma

2.6 精密度试验

分别配制探针药物3个浓度的标准血浆样品，其中氯唑沙宗和甲苯磺丁脲浓度分别为1,10,20μg·mL-1，咪达唑仑浓度分别为0.5,10,30μg·mL-1，每个浓度各5份，按2.3项下方法处理并测定，于同1天内进样5次测定，计算日内RSD；连续测定5d，求得日间RSD。结果表明精密度符合生物样本测定要求，见表2。

2.7 回收率试验

分别取氯唑沙宗和甲苯磺丁脲各1，10，20μg·mL-1，咪达唑仑0.5，10，30μg·mL-13种不同浓度的标准血浆样品，各5份，按2.3项下方法处理并测定，按标准曲线计算3种探针药物浓度，以测定值的平均值与配制的理论浓度比较，求得相对回收率。结果见表2。

表2 精密度与回收率结果（n=5）Tab.2 Precision and recovery results of probes

由表2可见，氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、咪达唑仑的回收率分别在96.22%～101.42%，98.72%～104.14%，97.09%～105.27%，回收率稳定，符合生物样本测定要求。

2.8 稳定性试验

取空白血浆配制含3个探针药物的低、中、高浓度的标准血浆样品，于-20℃冻存30d，反复冻融3次，室温放置24h，按2.3项下方法处理并测定，记录探针药峰面积和内标峰面积，求得样品浓度及RSD。见表3。

表3 探针药物稳定性考察结果（n=5）Tab.3 Stabilization determination results of probes

由表3结果可见，血浆样品中低、中、高浓度的3探针药物经-20℃冻存30d，反复冻融3次，室温存放24h后，氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、咪达唑仑的低、中、高浓度稳定性良好，其RSD均在10%内，符合生物样品测定要求。

3 结论

血浆药物浓度常用检测方法中，高效液相色谱法（HPLC）使用较为广泛。多种探针药物的测定方法大多选择HPLC梯度洗脱法，但基线不平稳，保留时间较长，操作比较复杂。因此，本实验通过调整流动相比例及调节pH值，最终选用甲醇和（NH4）2HPO4（pH值为3.4）作为流动相，其比例在54∶46时各探针药物和内标可分离完全，峰形良好。通过比较己烷、氯仿、二氯甲烷及苯的萃取效果，用氯仿作为萃取溶剂，内源性杂质较少，回收率和重现性均符合要求。

本研究建立的HPLC法具有选择性强，操作简便，灵敏度高的特点，适用于在同一色谱条件下同时测定3种CYP450亚型酶探针药物的浓度，因而能够同时检测各亚型酶的活性，对于评价药物间相互作用以及指导临床合理用药具有重要的意义。