核磁共振定量技术测定原薯蓣皂苷对照品的含量

韩 君，林 帅

（1.北京康仁堂药业有限公司 中药配方颗粒关键技术国家地方联合工程研究中心，北京 101301；2.康龙化成（北京）新药技术股份有限公司，北京 100176）

原薯蓣皂苷（protodioscin），分子式为C51H84O22，属于甾体皂苷，又名呋喃固醇皂苷，有多种药理作用，如增强性功能、降血脂作用、对癌细胞的毒杀作用和抗白血病作用[1]。原薯蓣皂苷为穿山龙主要生物活性成分，由于其在中药提取过程中易发生转化反应[2]且分离纯化中易存有杂质[1]，且原薯蓣皂苷极具吸湿性，在应用常规的含量测定方法，如高效液相色谱法[3]、液质联用法[4]等进行测定时，其结构不稳定，结构紫外吸收较弱，易受杂质干扰等造成含量测定不准确[5]，且耗费大量人力物力。因此，有必要探索新的技术与方法对原薯蓣皂苷的含量进行测定。

核磁共振定量技术（qNMR）不受残留溶剂、水分、无机杂质（灰分）及活性成分杂质的影响，测定对照品的绝对含量，其测定时间短、样品量少等优点[6]，近年来广泛应用在对照品和药品的质量控制研究领域[7-12]，应用qNMR对原薯蓣皂苷对照品含量测定未见报道。本文应用qNMR测定原薯蓣皂苷含量，为在无对照品情况下进行含量测定和相应质量控制建立方法。

图1 原薯蓣皂苷的化学结构Fig.1 Chemical construction of protodioscin

1 实验部分

1.1 仪器与材料

Bruker AVANCEII 500MHz超导脉冲傅里叶变换核磁共振波谱仪（瑞士布鲁克公司）；FA2004N型电子天平（上海菁海仪器有限公司）；1～200μL移液枪（Thermo公司）。

氘代吡啶（氘代度＞99.9%美国CIL公司）；TMS（北京化工厂）；原薯蓣皂苷（102498江苏永健医药科技有限公司）；RFS-Y13011812016（成都瑞芬思生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液制备

内标溶液配制 1μL内标加3mL吡啶配成浓度为0.22mg·mL-1溶液。

样品溶液配制 称量原薯蓣皂苷对照品2.7mg，溶解在0.4mL含有内标溶液的吡啶溶剂中。

线性溶液配制 将20mg标准品溶解在1mL的吡啶溶剂中配成浓度为20mg·mL-1的标准溶液，依次往核磁管加入上述100,150,200,250,300μL标准溶液，再依次加入300,250,200,150,100μL的吡啶溶剂。

1.2.2 核磁实验条件

1H NMR的工作频率为500.13MHz，谱宽为50000.50Hz，测试温度为25℃，环境湿度为45%，采集时间3s，扫描次数16次，激发脉冲为12.11us。在对谱图进行处理之前，先进行相位校正和基线调平。所有谱图均采用Topspin 4.0.8软件处理。

1.2.3 qNMR计算公式

采用（1）式计算原薯蓣皂苷对照品含量：

式中 As、Ar：供试品特征峰和内标峰的峰面积；Ms、Mr：供试品和内标物的分子量；ns、nr：供试品特征峰和内标物的质子数；ms、mr：供试品和内标物的质量；Wr：内标物的质量分数。

2 结果与讨论

2.1 原薯蓣皂苷氢谱解析

按照NMR实验条件测定结果采集图谱，样品及内标的氢谱见图2，样品的氢谱解析见表1。

表1 原薯蓣皂苷核磁共振氢谱特征信号的归属Tab.1 1H NMR data for protodioscin in pyridine-d5

因原薯蓣皂苷和TMS在氘代吡啶中溶解度良好，且氘代吡啶的溶剂峰处于较低场，与内标物和样品特征峰无干扰，因此，选择氘代吡啶为溶剂。采用NMR对物质进行定量时，供试品与内标物通常会有很多峰。按qNMR定量要求，用于定量的供试品特征峰和内标峰应选择与其它峰完全分离，没有杂质峰干扰。按照上述要求，选择TMS作为内标峰，以原薯蓣皂苷的峰δ5.84为供试品的定量峰。

2.2 线性关系

取1.2.1项下5个供试品的溶液，测定氢谱，分别对原薯蓣皂苷特征峰和TMS内标信号的峰面积进行积分，结果见表2。

表2 原薯蓣皂苷和TMS的质量及峰面积积分值Tab.2 Mass and peak area integral value of protodioscin and TMS

以原薯蓣皂苷特征峰和TMS的积分面积比值y对原薯蓣皂苷和TMS质量比值x做线性方程，得到回归方程为y=0.2035x-0.572，其相关系数r=0.994。结果表明，线性关系良好。

2.3 精密度试验

取“线性”项下4号样品，按照1.2.2项实验条件连测6次，以原薯蓣皂苷特征峰和TMS积分面积比值计算分别为1.03、1.02、1.03、1.02、1.02、1.03，RSD为0.53%，表明精密度良好。

2.4 重复性试验

按照1.2.1项下供试品溶液制备，平行制备供试品溶液6份，按照1.2.2项实验条件进行测定，以原薯蓣皂苷特征峰和TMS积分面积比值计算分别为0.68、0.68、0.68、0.68、0.67、0.68，RSD为0.60%，表明重复性良好。

2.5 稳定性试验

取“线性”项下4号样品，按照1.2.2项实验条件，分别于0、4、6、8、10h测定，以原薯蓣皂苷特征峰和TMS积分面积比值计算分别为1.02、1.01、1.02、1.02、1.03，RSD为0.69%，表明稳定性良好。

2.6 耐用性试验

取“线性”项下4号样品，分别在温度为25和30℃下测定，以原薯蓣皂苷特征峰和TMS积分面积比值计算分别为1.03、1.04，RSD为0.68%，表明耐用性良好。

2.7 样品测定

按照1.2.1项下供试品溶液制备，测定原薯蓣皂苷对照品的特征峰及其内标TMS的积分面积，根据计算公式（1）求得原薯蓣皂苷的绝对含量，同时采用HPLC峰面积归一化法测定原薯蓣皂苷对照品的相对含量，结果见表3。

表3 原薯蓣皂苷含量测定结果Tab.3 Determination results of the content of protodioscin

3 结论

本文采用qNMR测定原薯蓣皂苷对照品含量，结果其线性、精密度、耐用性、重复性、稳定性均良好。qNMR法相对于常规方法具有以下优点，核磁信号能给出样品结构信息，无需特定对照品，内标物廉价易得，方法简便快捷。因此，qNMR测定原薯蓣皂苷对照品含量的方法可行，具有进一步研究的潜力与价值。