郝亚娟,刘颖斌
1.上海交通大学医学院附属新华医院普外科,上海市胆道疾病研究中心,上海200092;2.上海市胆道疾病研究重点实验室,上海200092;3.上海交通大学医学院附属仁济医院胆胰外科,癌基因与相关基因国家重点实验室,上海市肿瘤研究所,上海200120
RNA 修饰在生命活动和疾病发生、发展中发挥着重要的作用。目前,已有150 多种RNA 修饰,涉及信使RNA (messenger RNA,mRNA)、非编码RNA (noncoding RNA, ncRNA)、 转运RNA (transfer RNA,tRNA)、核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)、核内小RNA (small nuclear RNA, snRNA) 和核仁小RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)。其中,甲基化修饰是一种非常广泛的修饰,约占RNA总修饰类型的2/3。甲基化修饰发生在RNA 上的位置主要是碱基的氮原子(N)、嘌呤和嘧啶的碳原子(C)、2′-OH的氧原子(O)上。氮6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenine,m6A)修饰是其中具有代表性的修饰之一。
m6A 修饰是真核生物mRNA 中一种高丰度的表观转录组学修饰。m6A 广泛分布在自然界,包括植物、动物、原核生物和病毒中。m6A 分布在不同的RNA 类型中。在古生菌和细菌中,主要分布于tRNA 和rRNA;在真核生物中,除分布于rRNA 外,还分布于mRNA 和ncRNA 中。不同mRNA 的m6A 水平是不同的。在每1 000 个核苷酸中,约有32个GAC/AAC位点,但其中只有1~2个能被甲基化。一般mRNA 的平均长度为3 kb,测序可检测到1~5个m6A修饰[1-2]。
化学方法和m6A 免疫共沉淀高通量测序(m6Aspecific methylated RNA immunoprecipitation high throughput sequencing,meRIP-seq)发现m6A 保守的基序为RRACH(R 通常为G 和A,H 通常为A、C 和U),其中最经典的基序为GGACU。在人和小鼠细胞中,目前发现约有7 000个mRNA 存在m6A 修饰,且具有很高的保守性。meRIP-seq 揭示了这种甲基化修饰主要分布在mRNA的编码区、剪切位点附近和靠近终止密码子的3′非编码区(3′untranslated region,3′UTR);此外,m6A 在长的外显子区也有分布[1-2]。
RNA m6A 修饰是动态可逆的,发挥着重要的分子功能。RNA m6A 修饰由甲基转移酶复合物Wilms’肿瘤蛋白1 相关蛋白(Wilms’ tumor 1-associating protein,WTAP)/甲基转移酶样3 (methyltransferase like 3,METTL3)/甲基转移酶样14(methyltransferase like 14,METTL14)以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)为甲基供体催化形成[3-5],由去甲基化酶α-酮戊二酸依赖的加双氧酶AlkB 同源蛋白5(AlkB homolog 5,ALKBH5)[6]或FTO (FTO α -ketoglutarate dependent dioxygenase)[7]在Fe2+、α-酮戊二酸辅助下催化去除,能被含有YTH 结构域的m6A 读码器,如YTH 结构域m6A RNA 结合蛋白1~3 (YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1-3,YTHDF1-3)、YTH 结构域包含蛋白1~2(YTH domain containing 1-2,YTHDC1-2)识别。定位在细胞质的YTHDF2 能够调控mRNA 的稳定性,YTHDF1 和YTHDF3 能够调控mRNA 的翻译效率,YTHDC2 能够促进翻译;定位在细胞核的YTHDC1 能够调控前体mRNA 的可变剪接[8]、出核[9]、X 染色体沉默[10]。此外,微RNA(microRNA,miRNA)能够通过序列配对机制调控mRNA m6A的水平[11]。
后来的研究相继发现了一些m6A 的修饰酶,包括甲基转移酶的组分vir 样m6A 甲基转移酶相关(vir like m6A methyltransferase associated,VIRMA,KIAA1429)、锌指CCCH 类包含蛋白13(zinc finger CCCH-type containing 13,ZC3H13)、Cbl 原癌基因样1 (Cbl proto-oncogene like 1,HAKAI)、RNA 结合基序蛋白15/15B (RNA binding motif protein 15/15B,RBM15/15B),它们能催化大部分的RRACH 基序甲基化;另外一个甲基转移酶——甲基转移酶样16(methyltransferase like 16,METTL16)能催化甲硫氨酸腺苷转移酶 2A (methionine adenosyltransferase 2A,MAT2A)发卡结构顶部的UAC(m6A)GAGAA甲基化。其中一类结合蛋白,不均一核糖核蛋白C/G (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C/G,HNRNPC/G)和不均一核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1,HNRNPA2B1)能够识别茎环结构的m6A 修饰并调控其茎和环结构的转换,当其有m6A 修饰并结合时,主要为环结构,没有m6A 修饰时为茎结构。另外一类结合蛋白为常见的RNA 结合蛋白,如含有KH 结构域的胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白1~3(insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 1-3,IGF2BP1-3) 和RGG 结构域的FMRP 翻译调节子1(FMRP translational regulator 1,FMR1)。除此之外,脯氨酸丰富的卷曲螺旋2A (proline rich coiled-coil 2A,PRRC2A)能够识别m6A并影响少突胶质细胞发育和髓鞘形成。
对m6A相关酶的功能研究发现,这些基因活性异常导致了上千种基因的表达异常,提示了m6A在RNA代谢方面的重要作用。m6A可能影响脂肪代谢、精子发育、肿瘤生成[12-13]、干细胞定向分化、细胞重编程、生物钟节律、细胞分裂、记忆和神经发育以及其他一些生命过程。
FTO 和ALKBH5 是人类中大肠杆菌DNA 烷基化去甲基化酶AlkB 同源蛋白家族成员,含有保守的结合二价铁离子的组氨酸-天冬氨酸-组氨酸(histidine-aspartic acidhistidine,HDH)结构域和结合2-酮戊二酸以及识别RNA底物的精氨酸-x-x-精氨酸(arginine-x-x-arginine,RxxR)功能结构域。
FTO 是第一个被发现的m6A 的去甲基化酶,涉及多种疾病,如肥胖、糖尿病、急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia,AML)、恶性胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、阿尔茨海默病等。
2.1.1 FTO在肿瘤发生和发展中的作用
(1) FTO 与AML FTO 高表达于AML 的一些特定亚型中,如t(11q23)/MLL 重排型、t(15;17)/PMLRARA 型、FLT3-ITD 型及NPM1 突变型。FTO 能增加AML原癌基因介导的细胞转化,促进AML的发生。FTO通过去除其靶标锚蛋白重复和SOCS 盒包含2(ankyrin repeat and SOCS box containing 2,ASB2)及维甲酸受体α(retinoic acid receptor α,RARA)mRNA上的m6A甲基化修饰,抑制ASB2和RARA的表达,从而抑制全反式维甲酸(all-transretinoic acid,ATRA) 诱导的AML 细胞分化[14]。
(2) FTO 与恶性胶质瘤 RNA m6A 甲基化修饰能促进恶性胶质瘤干细胞的自我更新和肿瘤生成。敲低RNA m6A 甲基转移酶复合物的关键组分METTL3或METTL14,能明显促进人类恶性胶质瘤干细胞的生长、自我更新和肿瘤生成。反之,过表达METTL3或使用抑制剂抑制RNA m6A 的去甲基化酶FTO,能抑制恶性胶质瘤干细胞的生长和自我更新。而且,抑制FTO 能抑制恶性胶质瘤的进展,延长荷瘤小鼠的存活时间。RNA m6A 甲基化测序发现METTL3或METTL14敲低后,恶性胶质瘤干细胞中一些具有关键生物学功能的基因的mRNA m6A 修饰水平和mRNA 表达水平发生变化,如ADAM 金属肽酶结构域19 (ADAM metallopeptidase domain 19,ADAM19)。这些结果提示mRNA m6A 甲基化修饰可能是恶性胶质瘤的一个潜在的治疗靶标[15]。
(3) FTO 与黑色素瘤 mRNA m6A 去甲基化酶FTO能促进黑色素瘤的生长,抑制抗程序性死亡蛋白-1(programmed death-1,PD-1)的免疫治疗效果。FTO 在人黑色素瘤中高表达,能促进小鼠的黑色素瘤生成。代谢饥饿压力诱导自噬和核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路激活,进而激活FTO。敲低FTO能增加关键的促癌的黑色素瘤细胞的基因包括PD-1、C-X-C 基序趋化因子受体4 (C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4) 和SRY 盒转录因子10 (SRY-box transcription factor 10,SOX10)的m6A 甲基化水平升高,导致m6A 结合蛋白YTHDF2 引起的RNA 降解增加。在小鼠中,敲低FTO能增加黑色素瘤细胞对γ 干扰素(interferon γ,IFNγ)和抗PD-1 治疗的敏感性,激活适应性免疫。这些结果提示,将FTO 的抑制剂和抗PD-1 治疗结合起来,或许能抑制黑色素瘤的免疫逃逸[16]。
(4) FTO 与乳腺癌 mRNA m6A 去甲基化酶FTO 在乳腺癌中高表达,并与患者的预后呈负相关。FTO 能在体外和体内促进乳腺癌细胞系的增殖、克隆形成和转移。BCL2 互作蛋白3(BCL2 interacting protein 3,BNIP3)是一个促凋亡基因,是FTO 的下游靶标。FTO 能去除BNIP3mRNA 3′UTR 的m6A 甲基化修饰,促进BNIP3的降解,但其降解不依赖于m6A结合蛋白YTHDF2。BNIP3在乳腺癌患者中呈现出抑癌作用,与FTO 的表达呈负相关。BNIP3 能明显抑制FTO 介导的乳腺癌增殖和转移。FTO在乳腺癌中或许能成为一个新的治疗靶标[17]。
(5) FTO 与非小细胞肺癌 mRNA m6A 去甲基化酶FTO 在非小细胞肺癌中高表达,m6A 修饰水平降低。敲低FTO能在体外或体内抑制癌细胞系的增殖、克隆形成或裸鼠成瘤。FTO 能去除泛素蛋白特异性蛋白酶7(ubiquitin specific peptidase 7,USP7)的m6A 甲基化修饰并增加其mRNA的稳定性。USP7的mRNA水平在人肺癌组织中高表达,并且与FTO的mRNA 水平呈正相关。敲低或使用抑制剂P5091或P22027降低USP7的水平,能抑制肺癌细胞系的增殖、克隆形成。敲低FTO引起的肺癌细胞系增殖缓慢能被USP7的过度表达而回补修复。因此,mRNA m6A 去甲基化酶FTO 能通过增加USP7的表达促进非小细胞肺癌的发展[18]。
(6) FTO 与肺鳞癌 通过分析癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库得知FTO 与肺鳞癌的预后相关。与其他的m6A 修饰酶(如METTL3、METTL14、ALKBH5)相比,FTO 能特异性地引起肺鳞癌中m6A 修饰异常。敲低FTO能抑制肺鳞癌细胞系的增殖和侵袭,促进细胞凋亡。反之,过表达野生型FTO而不是其突变体,能促进肺鳞癌细胞系的恶性表型进展。FTO通过去甲基化髓系锌指1 (myeloid zinc finger 1,MZF1)的m6A 修饰并增加其mRNA 的稳定性来促进肺鳞癌的发展[19]。
2.1.2 FTO抑制剂
目前,已有文献[20-30]报道了一些有效的FTO 抑制剂(表1)。甲氯芬那酸(meclofenamic acid,MA)能与FTO而不是ALKBH5 竞争性地结合含有m6A 的RNA,从而间接并选择性地抑制FTO 的活性[20]。 恩他卡朋(entacapone)在体外能直接结合并抑制FTO 的活性。在饮食诱导的肥胖小鼠模型中,饲喂恩他卡朋,叉头盒O1(forkhead box O1,FOXO1)mRNA 作为FTO 的直接作用底物,能诱导肝内糖原异生和脂肪组织生热作用,导致小鼠体质量减轻、空腹血糖浓度降低[21]。小分子抑制剂FB23 和FB23-2 能直接结合FTO 并选择性地抑制FTO 的m6A 去甲基化酶活性。在体外,使用FB23-2 抑制FTO 的表达,能显著地抑制人AML 细胞系和原代AML 细胞的增殖并促进其分化和凋亡;在小鼠移植模型中,FB23-2能显著抑制人AML 细胞系和原代细胞的恶性进展。该结果提示FTO 能作为一个药物靶标,靶向FTO 的小分子抑制剂展现出了治疗AML的潜能[22]。
表1 FTO的抑制剂及其作用方式Tab 1 Inhibitors of FTO and their modes of action
ALKBH5 倾向于结合特异性的m6A 修饰的单链RNA催化其去甲基化。ALKBH5 定位于细胞核内的亚细胞器——核小斑,提示其可能参与RNA 前体的可变剪接,ALKBH5基因敲低能促进mRNA 出核,ALKBH5敲除还与精子发育密切相关[6]。ALKBH5基因在恶性胶质瘤中通过维持叉头盒M1(forkhead box M1,FOXM1)的表达和细胞增殖来维持其中干细胞样细胞的致肿瘤性,降低ALKBH5基因表达将显著抑制肿瘤的生长[31]。
Imidazobenzoxazin-5-thione MV1035 是ALKBH5 的抑制剂,能抑制ALKBH5 在恶性胶质瘤细胞系U87 中通过下游蛋白——细胞外5′核苷酸酶(ecto-5′-nucleotidase,CD73)发挥的促进肿瘤迁移和侵袭的作用[32]。
METTL3通常与其同源家族蛋白METTL14以1∶1的比例形成异源二聚体,再和WTAP 形成复合物发挥甲基化催化功能。WTAP 为RNA 结合蛋白,首先结合到RNA上,进而招募METTL3和METTL14行使催化功能。它们三者之间存在直接的相互作用,共定位于富含剪切因子的细胞核内的亚细胞器核小斑上。METTL3 是它们三者中最早被鉴定的RNA m6A 甲基转移酶,关于其在肿瘤等疾病中的作用已有报道[33-36]。
在AML 中,定位到转录起始位点(transcriptional start site,TSS)的CCAAT 增强子结合蛋白ζ(CCAAT enhancer binding protein ζ,CEBPZ)能招募METTL3 结合到染色体上靶基因的启动子TSS 上,进而METTL3 能使这些靶基因mRNA 编码区产生m6A 甲基化修饰,增强翻译,促进AML 发展。下调METTL3 能引起细胞周期阻滞、白血病细胞分化,并能阻止免疫缺陷小鼠形成白血病[33]。METTL3 能抑制造血干/祖细胞分化并促进其增殖。在AML 中,METTL3 高表达,METTL3 生成的m6A促进MYC 原癌基因、bHLH 转录因子(MYC protooncogene,bHLH transcription factor,c-MYC)、BCL2 凋亡调节子(BCL2 apoptosis regulator,BCL2)、同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)的翻译,促进AML 发展。METTL3 缺失导致AKT 丝氨酸、苏氨酸激酶(AKT serine/threonine kinase,AKT)的磷酸化增加,使AML 细胞分化和凋亡,延缓AML 进程[34]。在胃癌中,METTL3 介导的肝素结合生长因子(heparin binding growth factor,HDGF)的m6A 修饰增多,导致血管生成和糖酵解增加,从而促进胃癌的生长和肝转移[35]。在肝癌中,METTL3 高表达并能甲基化细胞因子信号2 的抑制子(suppressor of cytokine signaling 2,SOCS2) RNA 使其被m6A 修饰,甲基化的SOCS2RNA易被YTHDF2 介导降解,从而促进肝癌的生长和转移[36]。
METTL3 可能成为肿瘤治疗的一个重要的药物靶点,但目前关于其小分子抑制剂的研究较少。有学者通过筛选它的甲基化供体SAM 的类似物和衍生物库,选取了其中6 种进行了蛋白晶体学的验证,发现其中有2 种有较好的配位基活性[37]。
目前关于m6A 修饰在肿瘤发生、发展中的重要性越来越明确,某些抑制剂展现出临床应用潜能,但是对于其在胆囊癌中的研究较少。胆囊癌是一种常见的胆道系统恶性肿瘤,易转移,患者预后非常差。本课题组通过全基因组测序和外显子测序发现了胆囊癌中的基因组变异,尤其是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,ErbB)通路上的突变,其中erb-b2 受体苏氨酸激酶2 和3(erb-b2 receptor tyrosine kinase 2/3,ERBB2/3)的突变能促进CD274分子(PD-L1)介导的胆囊癌免疫逃逸[38-39]。 我们对RNA 上的5- 甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,m5C)修饰在胆囊癌中的调控作用与分子机制开展了研究,发现RNA m5C 甲基转移酶NOP2/Sun RNA 甲基转移酶2(NOP2/Sun RNA methyltransferase 2,NSUN2)协同核糖体蛋白大亚基6(ribosomal protein L6,RPL6)促进了胆囊癌的增殖[40]。NSUN2 在胆囊癌中高表达,能促进胆囊癌细胞系的增殖和克隆形成,促进裸鼠皮下成瘤。NSUN2 和RPL6 存在相互作用,敲低RPL6能够降低NSUN2 的蛋白水平,并能抑制胆囊癌细胞系的增殖和克隆形成;同时回补NSUN2,能修复胆囊癌细胞系的表型。此外,我们对RNA m5C 修饰在胆囊癌中的修饰谱以及分子机制开展了一定的研究。
RNA m6A 修饰在胆囊癌中的调控作用目前还没有报道,这可能是未来胆囊癌表观遗传调控的一个研究方向。目前我们已经发现了一些RNA m5C 和m6A 修饰互相调控的证据。这2种修饰对胆囊癌的共同调控也是未来的一个研究方向,将为靶向RNA 修饰在胆囊癌的精准治疗提供理论支持。
参·考·文·献
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