高效液相色谱-柱后光化学衍生法测定变性淀粉中黄曲霉毒素含量的研究

杨 娟

上海工微所科技有限公司，上海 200233

黄曲霉毒素(aflatoxins，AFT)是一种天然毒素，在很多食品中普遍存在，它毒性大，致癌性强，对人类健康危害极大[1]。目前常见的黄曲霉毒素有G2、G1、B2和B1。由于其结构稳定，在食物加工过程中不易被破坏，如不慎食用，对人体伤害极大，为了保障食品安全，我国国家标准GB 2761—2017《食品国家安全标准食品中真菌毒素限量》[2]中规定了黄曲霉毒素B1的最高限量，但未列出B2、G1和G2的限量要求，因此有必要建立一种快速简便、稳定可靠的检测黄曲霉毒素含量的方法，为食品中黄曲霉毒素的限量标准提供科学依据。

目前检测黄曲霉毒素的方法很多，如液相色谱-质谱联用法，液相色谱-柱前柱后衍生法，酶联免疫法，薄层色谱法等[3]，其中高效液相法/荧光检测是较为常见的一种检测方法，然而由于荧光检测器对黄曲霉毒素具有选择性，即对AFTB1和AFTG1的检测灵敏度较低，所以需要通过柱前或柱后衍生增强其荧光性，提高检测灵敏度[4]。而高效液相色谱-光化学衍生法是在高效液相色谱仪上连接光化学衍生器，利用环状化合物在紫外光照射下能产生荧光这一特性[5]，实现了对黄曲霉毒素的在线衍生和检测，大大增强黄曲霉B1和G1的荧光强度，有效地提高了检测效率[6]。

本试验采用高效液相色谱-光化学柱后衍生法检测变性淀粉中黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1含量。变性淀粉使用乙腈-水溶液(84∶16，v/v)提取，提取液经免疫亲和柱或多功能净化柱净化处理，用HPLC光化学衍生-荧光检测器检测样品中黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1含量，快速可靠。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品：市售羟丙基二淀粉磷酸酯。

美国Beacon黄曲霉毒素总量免疫亲和柱(上海安谱实验科技股份有限公司)；MycoSep 226多功能净化柱(Romer国际贸易(北京)有限公司)；黄曲霉标准品(G1：1.00 μg/mL；G2：0.300 μg/mL；B1：1.00 μg/mL；B2：0.300 μg/mL;上海安谱实验科技股份有限公司)；甲醇，乙腈(色谱纯，DIKMA)；氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钾(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；吐温-20，分析纯(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪配荧光检测器(U3000，赛默飞世尔科技公司)，柱后衍生装置(SSIAllChrom Derivatization Unit柱后光衍生系统FCR-1，美国科学系统公司)，电子天平(MS204TS，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，超声波清洗器(KQ-100，昆山市超声仪器有限公司)，离心机(TDL-5A，上海安亭科学仪器厂)，固相萃取仪(Supelco SPE)，漩涡混匀器(IKA VORTEX 3，德国IKA公司)，隔膜真空泵(LH-95D，临海市永昊真空设备有限公司)，EFTT-DC12 防腐氮吹仪(上海安谱实验科技股份有限公司)，超纯水机(RiOs Essential默克化工技术(上海)有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18；Analytical 4.6×250 mm 5-Micron.

流动相：乙腈∶甲醇∶水=10∶30∶60(v/v)；

流速：1.0 mL/min；柱温:40 ℃；进样量：75.0 μL

荧光检测器检测波长：激发波长360 nm，发射波长440 nm；

1.3.2标准溶液的配制

用乙腈将标准品稀释100倍，至黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1浓度分别为3.00 μg/L、10.0 μg/L、3.00 μg/L和10.0 μg/L，再将储备液逐步稀释，即得标准系列溶液，见表1。

表1 黄曲霉毒素标准系列溶液浓度

1.3.3样品处理

提取：称取变性淀粉样品5.00 g于50 mL离心管中，加入20.0 mL乙腈-水溶液(84∶16，v/v)提取，震荡摇匀。超声20 min，4 000 r/min离心5 min，过滤，备用。

免疫亲和柱净化：移取4.00 mL提取液，加入46 mL 1%吐温-20的磷酸盐缓冲液，混匀，将免疫亲和柱连接上样器，将上述混合液转移至上样器中，使液滴以2 mL/min速度下滴，试样液滴完后用20 mL水淋洗亲和柱，待水滴完后，抽干亲和柱，弃去淋洗液，再用2 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于离心管中。在50 ℃下氮吹至近干，冷却后用0.40 mL流动相复溶，0.45 μm滤膜过滤，待测。

MycoSep 226多功能净化柱净化：移取提取液置多功能净化柱净化，取净化液4.00 mL于离心管中。在50 ℃下氮吹至近干，冷却后用0.40 mL流动相复溶，0.45 μm滤膜过滤，待测。

2 结果与分析

2.1 HPLC检测色谱图

AFTG2、AFTG1、AFTB2和AFTB1标准品的HPLC色谱图见图1。由图1可知，AFTG2、AFTG1、AFTB2和AFTB1均达到了很好的基线分离，目标峰未出现变形、拖尾等现象，出峰时间分别在10.0 min、12.0 min、14.3 min和17.5 min。由表2可知，在0.075 0 μg/L～10.0 μg/L，AFTG1和AFTB1具有良好的线性关系。在0.022 5 μg/L～3.00 μg/L，AFTG2和AFTB2具有良好的线性关系，相关系数在0.999 3～0.999 7之间。

表2 黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的线性方程、线性范围、相关系数和检出限

图1 标准溶液色谱图

2.2 检出限

以3倍信噪比作为仪器检出限，得出黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1的仪器检出限依次为0.022 5 μg/L、0.075 0 μg/L、0.022 5 μg/L和0.075 0 μg/L，方法检出限为为0.010 0 μg/kg、0.030 0 μg/kg、0.010 0 μg/kg和0.030 0 μg/kg。

2.3 回收率

对变性淀粉样品进行3个不同水平加标实验，每个加标水平重复六次，按照1.3.3方法进行提取、净化检测，结果如表3所示。四种黄曲霉毒素在不同水平加标中，其平均回收率为96%～104%之间，相对标准偏差RSD为1%～3%之间，说明该方法能较好地检测样品中黄曲霉毒素含量，且重复性较好。

表3 黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的加标回收率(n=6)

2.4 与高效液相色谱-柱前衍生方法的比较

食品安全国家标准《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》GB 5009.22—2016中[3]第二法(高效液相色谱-三氟乙酸柱前衍生法)和第三法(高效液相色谱-柱后光化学衍生法)是较为常见的两种检测方法。高效液相色谱-三氟乙酸柱前衍生法是基于使AFTB1和AFTG1的荧光性增强，解决了黄曲霉毒素B1和G1因灵敏度低而达不到痕量检测要求的问题[7]。

图2是高效液相色谱-三氟乙酸柱前衍生法所得的色谱图。由图可知，柱前衍生法的检测时间为35 min，而柱后光化学衍生的检测时间为25 min，提高了检测效率。同时减少了三氟乙酸、正己烷等有害试剂的使用。两种方法色谱图均能达到较好的分离，且回收率较好。

图2 黄曲霉毒素标准溶液柱前衍生色谱图

2.5 免疫亲和柱与多功能净化柱的比较

黄曲霉毒素常用的净化方式有免疫亲和柱和多功能净化柱[8]。本试验比较了免疫亲和柱及MycoSep 226多功能净化柱对测定变性淀粉中黄曲霉G2、G1、B2、B1的净化效果。选择变性淀粉作为样品并进行加标实验，采用上述两种净化柱分别净化，得到的样品色谱图如图3所示。

由图3B可见，经过免疫亲和柱净化的样品，基本可以消除杂质对黄曲霉毒素的干扰问题。两种净化柱测定样品中黄曲霉毒素B1的含量分别为0.063 8 μg/kg和0.065 8 μg/kg，相对标准偏差为2.18%，说明两种净化柱得出的数据没有显著差异，均能用于检测变性淀粉中黄曲霉毒素时的净化。然而，采用MycoSep 226多功能净化柱净化，在目标峰前面出现大量杂峰，而免疫亲和柱能够特异性的吸附样品中的黄曲霉毒素，使其与杂质分离，大量杂质被淋洗除去，因此，相对来说免疫亲和柱净化效果更好，检测灵敏度更高。总体而言，免疫亲和柱净化去除机制干扰能力较强，净化效果好；而多功能净化柱操作简单，价格便宜[7]。

(A：MycoSep 226多功能净化柱样品；B：免疫亲和柱样品；C：MycoSep 226多功能净化柱样品加标；D：免疫亲和柱样品加标)图3 不同净化柱对变性淀粉中黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1净化效果的比较

3 结论

本方法采用高效液相色谱-光化学衍生法测定变性淀粉中黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1含量，试验通过改变流动相比例，样品净化方法以及柱前衍生法和柱后光化学衍生法的方法进行对比。结果表明，与国标GB 5009.22—2016相比，采用本实验的流动相比例(乙腈∶甲醇∶水=10∶30∶60，v/v)缩短了仪器检测时间，且分离度较好。多功能净化柱和免疫亲和柱均能用于黄曲霉毒素的净化，两者测定结果无显著差异，相对于柱前衍生，柱后光化学衍生法能很大程度上节省仪器检测时间和检测成本，且能减少化学试剂对检测人员的伤害。因此，采用乙腈-甲醇-水作为流动相，多功能净化柱或免疫亲和柱净化，柱后光化学衍生，能有效检测变性淀粉样品中黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1的含量，且该方法简便，快速，检测成本较低，对检测人员伤害较小。