龙胆酵素的发酵工艺优化及其生化功效研究

陶宏兵，杨 娟，邓小锋，叶子翠，施庆珊，谢小保，黄小茉*

1.广东迪美新材料科技有限公司,广东 肇庆 526238;2.广东省微生物研究所 省部共建华南应用微生物国家重点实验室 广东省菌种保藏与应用重点实验室,广东 广州 510070

龙胆草(Gentiana Scabra Bge)又名龙胆、地龙胆、草龙胆，为龙胆科植物。据《神农本草经》记载，龙胆“主骨间寒热，惊痫邪气，定五脏，杀蛊毒。”2015版《中国药典》一部明确，龙胆草“清热燥湿，泻肝胆火”。我国龙胆产业规模化、产品系列化正在形成，传统产品形式主要为药用，起到抗菌、抗炎、健胃等功效[1,2]。近年随着化妆品原料越来越崇尚天然，龙胆在化妆品中的应用越来越多[3]。目前国内化妆品植物原料应用的较多的是以提取物形式加入，由于工艺的限制，提取物有效成分含量低，功效无法保证，且提取过程会添加较多醇类，违背了天然原料的初衷[4,5]。

本研究以龙胆草为发酵底物，利用微生物的发酵代谢作用，以龙胆苦苷为评价指标，对龙胆草进行深层次的加工制备成龙胆酵素，采用自由基清除和透明质酸酶抑制试验，验证其功效，为丰富龙胆草资源的化妆品应用及酵素新产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

龙胆草：产自云南昆明；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCC 2.3853:广东省微生物菌种保藏中心；植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CICC 21790：中国工业微生物菌种保藏中心。

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(yeast extract peptone dextrose，YPD)，LB培养基，广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

WJS1222F榨汁机，美的电器公司；UV200紫外分光光度计，广州昂科生物科技有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅，上海琪特分析仪器有限公司；IS-RDS4恒温摇床，广州仪新生物科技有限公司；TG16-WS台式高速离心机，上海恒科仪器有限公司，LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1龙胆酵素的制作

制作工艺：选取新鲜龙胆草，粉碎，按照料液比1∶10加入YPD培养基后灭菌，接入菌种发酵，静置澄清，上清离心过滤得到龙胆酵素。

1.3.2龙胆酵素发酵工艺优化正交试验

考虑各因素之间的交互影响，选择L9(33)正交表，以A菌株菌株组合(酿酒酵母，植物乳杆菌，酿酒酵母+植物乳杆菌)、B发酵温度(28 ℃，30 ℃和32 ℃)、C发酵时间(24 h，48 h和72 h)，设计3个因素3水平正交试验对发酵培养后龙胆酵素中的龙胆苦苷含量进行评价。

1.3.3龙胆苦苷含量测定

参照《中国药典》2015版[6]，通过高效液相色谱法进行检测。色谱柱Aglient TC-C18柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)；流动相：水-甲醇(75∶25V/V)，检测波长为270 nm；检测器：二极管阵列检测器。

1.3.4透明质酸酶抑制试验[7]

取0.1 mL 0.25 mmol/L CaCl2溶液和0.5 mL透明质酸酶37 ℃保温培养20 min，加入样品液0.5 mL，37 ℃保温培养20 min，加入0.5 mL透明质酸纳液，37 ℃保温培养30 min，常温放置5 min；加入0.1 mL 0.4 moL/L NaOH溶液和0.5 mL乙酰丙酮溶液，置于沸水中加热15 min后立即用冰水冷却5 min，加入埃尔利希试剂1.0 mL，放置20 min显色，用紫外分光光度计测定其吸光度值。

1.3.5自由基清除试验[8]

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

配置0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，用蒸馏水稀释样品成不同体积分数(4%～28%)的待测样。在酶标板上，加入100 μL DPPH溶液和100 μL梯度样品溶液，混匀，室温避光静置30 min，于λ=517 nm处测OD值。以无水乙醇作为空白对照，Vc(0.01 mg/mL～0.07 mg/mL)为阳性对照。

1.3.5.2 ·OH清除能力

对于范畴中心成员的确定，研究者有着不同的见解，其中宗守云(2011)在对“副”对名词性成分的选择和量词范畴化的中心成员的研究中，得到中心成员的确定有着下四个特征标准：(1)中心成员类别的出现频率很高；(2)从语言发展上看，中心成员类别在历史上出现最早；(3)从性质上看，它们是最简单最和谐的相配，具有简单性、具体性和客观性特征，在认知上处于中心地位；(4)从交际上看，范畴中心所代表的事物都是稳固的，常用的事物，在思维上具有优先性特征。这四个特征皆是从具体语料出发，从历时和共时两个维度结合人的认知方式概括得出。因此，范畴中心是一个范畴最本质的特征，有了这些特征才能开始去研究其扩展和非典型成员。

将样品稀释成不同体积分数(8%～56%)的待测样。取50 μL 6 mmol/L FeSO4溶液，50 μL 6 mmol/L H2O2溶液，200 μL 龙胆酵素溶液，摇匀，静置10 min，再加入50 μL 6 mmol/L水杨酸溶液，50 μL体积分数70%乙醇，摇匀，37 ℃反应30 min。于λ=510 nm处测OD值。用体积分数70%乙醇调零，Vc(0.01 mg/mL～0.07 mg/mL)为阳性对照。

将样品稀释成不同体积分数(10%～70%)的待测样，取0.5 mL样品溶液与1.5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCI缓冲液(pH 8.2)混合，25 ℃水浴20 min，然后加入0.2 mL 25 mmol/L的邻苯三酚，反应4 min，取浓盐酸0.25 mL终止反应。于λ=325 nm处测OD值。

2 结果与讨论

2.1 不同发酵条件对龙胆酵素中龙胆苦苷含量的影响

为确定龙胆酵素发酵的各个关键参数，选择菌株组合(A)、发酵温度(B)及发酵时间(C)，进行3因素3水平L9(33)正交试验，以龙胆苦苷含量作为龙胆酵素发酵工艺参数的评判指标，结果见表1。

表1 龙胆酵素发酵工艺优化正交试验结果

菌株组合、发酵温度及发酵时间这3个因素对应的极差(R)为RC>RB>RA，从而得知影响龙胆酵素发酵的主次因素为发酵时间>发酵温度>菌株组合。由极差分析可知，龙胆酵素发酵的最佳方案为A3B2C2，即发酵菌株为酿酒酵母+植物乳杆菌、发酵温度为30 ℃、发酵时间为72 h。在此条件下重复验证3次，结果表明，龙胆酵素的龙胆苦苷含量达(1 823±21)μg/mL，此条件下的酵素营养、抗敏舒缓效果更佳。

2.2 龙胆酵素对透明质酸酶的抑制作用

图1 龙胆酵素对透明质酸酶的抑制作用

透明质酸酶是能特异性分解透明质酸(HA)的一种蛋白水解酶。HA是构成细胞外和细胞间基质的主要成分，被分解后会引起细胞脱颗粒和介质渗漏，导致速发型过敏反应的发生。龙胆酵素可以抑制透明质酸酶活性，减少HA的分解，具有一定的抗敏止痒的功效[9]。

2.3 抗氧化能力

2.3.1DPPH清除能力

DPPH是一种稳定的氮中心自由基，在517 nm处有较强吸收值，通常被用来评估检测物质的抗氧化性[10]。IC50指自由基清除率为50%时对应的样品浓度，该值与物质的抗氧化能力呈反比关系。图2为不同浓度的龙胆酵素对DPPH自由基的清除能力。龙胆酵素对DPPH自由基清除率从23.5%上升到77.5%。经计算，龙胆酵素DPPH自由基的IC50为5%。PHILIPPE M等[11]研究表明，发酵物质对自由基清除率表现出差异受原料、微生物和发酵液代谢产物的影响。

图2 龙胆酵素对DPPH自由基清能力

图3 龙胆酵素对·OH自由基清能力

图4 龙胆酵素对自由基清能力

在体外抗氧化能力试验中发现，龙胆酵素的抗氧化活性较好。这可能是因为，在发酵过程中，龙胆酵素本身含有抗氧化成分如Vc等。除此之外，发酵过程中微生物使原料中的功能成分进行转化，多种功能成分的协同作用使其总抗氧化活性增强，但其具体的生理作用仍需进一步的研究。

3 结论