部分电化学还原氧化石墨烯修饰玻碳电极用于苦参碱的测定

陶 菡,黄 锐,刘 丰,田运霞,吴远根

(贵州大学 酿酒与食品工程学院 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵阳 550025)

苦参碱(MT)属于四环喹诺里西啶类生物碱,广泛存在于苦参、山豆根、苦豆子等中药的根中[1-2]。MT 是目前的研究热点[3-4],它不仅具有镇静、抗炎、抗寄生虫、抗肿瘤、抗过敏和抗骨质疏松等活性[5-6],还具有毒性小、成本低等优点,可将其开发成生物制剂(如苦参碱注射液),用于实际临床治疗。因此,建立一种简便、快速、灵敏的测定生物制剂中MT 含量的方法,对于MT 含量的监控具有十分重要的意义。

目前,MT 的测定方法主要有毛细管电泳法(CE)、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)等[7-8]。但这些方法均存在操作步骤繁琐、检测时间较长或仪器成本高昂等缺点,极大地限制了其应用。相比而言,电化学法具有操作简单、耗时短、灵敏度高和成本低等特点,可将其应用于MT 含量的测定。

电化学法中电极表面的修饰材料的选择非常关键。氧化石墨烯(GO)是一种表面含有丰富含氧官能团的二维碳纳米材料[9],具有大的比表面积和良好的生物相容性,可用作电极修饰材料[10-11]。然而,含氧官能团的存在引入了sp3缺陷,导致GO 导电性较差[12-13],可采用电化学法对其进行直接、高效地还原[14],得到还原度可控的还原GO[15]。据此,本工作采用恒电位法(IT)一步制备了部分电化学还原氧化石墨烯(p Er GO)修饰的玻碳电极(GCE),将其作为工作电极(p Er GO/GCE),并用于MT 注射液中MT 含量的测定,以期为MT 生物制剂的质量控制提供技术参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

CHI 660C型电化学工作站;A-10型超纯水仪;SB-5200 DTD 型超声清洗机。

MT 标准储备溶液:1.0×10-2mol·L-1,称取0.248 4 g MT 标准品,以水稀释定容配制而成。使用时用水稀释至所需浓度。

MT 标准品纯度不小于98%;MT 注射液(50 mg/5 mL);GO、Na H2PO4、Na2HPO4等试剂均为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

三电极体系:p Er GO/GCE为工作电极,铂丝为对电极,Ag/AgCl为参比电极;电解质为0.1 mol·L-1Na H2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH 7.0),测定前通氮气除去溶解氧;富集电位为开路电位;富集时间120 s;差分脉冲伏安法(DPV),扫描电位区间为0.4～1.4 V,电位增量4 m V,脉冲宽度0.05 s,采样宽度16.7 ms;测试温度为室温。

1.3 试验方法

1.3.1 GCE的预处理

分别用0.3,0.05μm 的Al2O3粉末将GCE 的表面抛磨至镜面,然后依次用纯净水、乙醇、超纯水超声,将电极清洗干净,并在0.1 mol·L-1Na H2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH 7.0)中用循 环伏安法(CV)进行活化,扫描电位-0.5～1.2 V,扫描速率0.05 V·s-1,直到得到稳定的CV 曲线。

1.3.2 修饰电极的制备

将25 mg GO 超声分散于5 mL 水中,将6μL GO 分散液滴涂在GCE 表面,室温下晾干,即得到GO/GCE。将 GO/GCE 置 于0.1 mol· L-1Na H2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH 7.0)中,采用IT还原电极表面的GO,还原电位为-0.75 V,还原时间为200 s,即可得到p Er GO/GCE。

1.3.3 样品的测试

用0.1 mol·L-1Na H2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH 7.0)将MT 注射液稀释1 000倍,按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 pEr GO/GCE制备条件的选择

2.1.1 GO 电化学还原方法

分别采用IT 和CV 还原GCE 上的GO,对比得到的2种修饰电极对1.0×10-4mol·L-1MT 标准溶液的DPV 电化学响应,结果见图1。

由图1可知:2种方法制备的修饰电极最大响应电流对应的还原电位分别为1.04 V(IT 还原)和1.09 V(CV 还原);与CV 还原制备的修饰电极相比,采用IT 还原制备的修饰电极的响应电流更大,峰形更对称。因此,试验选择IT 还原制备修饰电极。

图1 2种方法还原制备的修饰电极对MT 的DPV 响应曲线Fig.1 Curves showing DPV response of modified electrodes prepared by the 2 reduction methods to MT

为了考察2种还原方法所获得GO 的还原度,采用CV 分别记录2种修饰电极在0.1 mol·L-1Na H2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH 7.0)中的电化学行为,结果见图2。

图2 不同修饰电极在Na H2 PO4-Na2 HPO4 缓冲溶液(pH 7.0)中的CV 响应曲线Fig.2 Curves showing CV response of different modified electrodes in the Na H2 PO4-Na2 HPO4(pH 7.0)buffer solution

由图2可知:不还原时,修饰电极在-1.1 V 处有一个较大的还原峰,是由GO 含氧官能团还原得到的(曲线1);IT 还原后,该处的还原峰强度明显减弱(曲线2);CV 还原后,还原峰几乎消失(曲线3),这表明IT 还原的GO 仍保留了部分含氧官能团,而CV 还原的GO 则几乎被完全还原。图1和图2的结果表明:IT 还原获得的p Er GO 比CV 获得的完全还原氧化石墨烯Er GO 对MT 具有更好的响应性能,可能原因是p Er GO 上还残留的部分含氧基团为MT 提供了更多的电极结合位点。

2.1.2 还原电位和还原时间

还原电位是影响GO 还原度的重要因素,还原电位越高,还原度越小[15]。试验考察了还原电位对MT 峰电流的影响,结果显示:当还原电位为-0.75 V 时,MT 的峰电流最大。这是由于电位过低时,GO 的含氧官能团几乎都被还原,MT 在电极上的附着位点较少,导致峰电流较低;还原电位过高时,GO 还原度较低,电极导电性较差,导致峰电流较低;而还原电位为-0.75 V 时,GO 的含氧官能团被部分还原,电极不仅导电性较好,且含有较多附着位点,故峰电流最大。

试验还考察了还原时间对MT 峰电流的影响,结果显示:当还原时间为200 s时,MT 的峰电流最大。

因此,在制备修饰电极时,试验选择的还原电位为-0.75 V,还原时间为200 s。

2.2 MT的电化学行为

试验考察了1.0×10-4mol·L-1MT 标准溶液在GCE、GO/GCE 和p ErGO/GCE 上的DPV 电化学响应行为,以及p Er GO/GCE 对添加MT 前后的0.1 mol·L-1Na H2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH 7.0)的响应,结果见图3。

图3 DPV 响应曲线Fig.3 DPV response curves

由图3(a)可知:MT 在GCE 上的氧化峰峰电流较小,峰形较差,说明GCE 对MT 的电催化活性不好(曲线3);MT 在GO/GCE上的峰电流较GCE略高,但峰形仍然很差(曲线2);MT 在p Er GO/GCE上的峰电流较大且峰形较好,说明p Er GO/GCE对MT 具有较好的电催化能力(曲线1)。由图3(b)可知:p Er GO/GCE在空白电解质中无DPV响应(曲线4′),加MT 后,产生了明显的氧化峰,说明氧化峰是由MT 的氧化行为产生(曲线4)。

2.3 电化学检测条件的选择

2.3.1 电解质及电解质酸度

试验考察了p Er GO/GCE 分别在pH 均为7.0的Na H2PO4-Na2HPO4、KH2PO4-NaOH、H3BO3-Na2B4O7、K2SO4、NaCl溶液中对MT 的DPV 电化学响应行为,结果见图4。

图4 MT 在不同电解质中DPV 响应曲线Fig.4 Curves showing DPV response of MT in different electrolytes

由图4可知:修饰电极在不同电解质中对MT均有响应,但在Na H2PO4-Na2HPO4缓冲溶液中MT 的峰电流最大且峰形较好。因此,试验选择Na H2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH7.0)作为电解质。

试验考察了p Er GO/GCE 在不同酸度的Na H2PO4-Na2HPO4缓冲溶液中对MT 的DPV 电化学响应行为,结果见图5。

由图5可知:随着电解质酸度的降低,氧化峰峰电位左移,说明有质子参与了MT 的氧化反应;氧化峰峰电流随着酸度的降低先升高后降低,当电解质酸度达到pH 7.0时,峰电流较大。因此,试验选择的电解质酸度为pH 7.0。

图5 MT 在不同酸度电解质中DPV 响应曲线Fig.5 Curves showing DPV response of MT in electrolytes with different acidity

2.3.2 富集时间和富集电位

试验考察了富集时间对MT 氧化峰峰电流的影响,结果显示:峰电流随着富集时间的延长而增加,这是由于富集时间会增加MT 在电极表面的富集量;当富集时间大于120 s时,峰电流基本不变,说明MT 在电极表面的富集量基本达到饱和。因此,试验选择的富集时间为120 s。

试验还考察了富集电位对MT 峰电流的影响,结果显示:富集电位对峰电流几乎没有影响。因此,试验选择的富集电位为开路电位。

2.4 标准曲线和检出限

在优化的仪器工作条件下,用p Er GO/GCE 对8.0×10-6,1.0×10-5,2.0×10-5,4.0×10-5,6.0×10-5,8.0×10-5,1.0×10-4mol·L-1MT 标准溶液系列进行测定。以MT 的浓度为横坐标,其对应的氧化峰峰电流为纵坐标绘标准曲线,线性范围为8.0×10-6～1.0×10-4mol·L-1,线性回归方程为y＝0.104 8x＋0.202 4,相关系数为0.995 0。

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),所得结果为4.0μmol·L-1。

2.5 精密度试验

按照仪器工作条件用p ErGO/GCE 对1.0×10-4mol·L-1MT 标准溶液进行5次平行测定,测定值的相对标准偏差(RSD)为1.8%,说明所建方法重现性较好。

按照试验方法制备5 支p Er GO/GCE,并对1.0×10-4mol·L-1MT 标准溶液进行测定,测定值的RSD 为2.3%,说明所建方法再现性较好。

2.6 回收试验

取MT 注射液样品稀释后(标示值为40.26×10-3mol·L-1)用p Er GO/GCE 进行测定,平行测定5次,测定值为37.90×10-3mol·L-1,RSD 为3.6%,与标示值的相对偏差为-5.9%。另取一份样品进行加标回收试验(先加标,再稀释),并计算回收率,结果见表1。

表1 回收试验结果(n＝5)Tab.1 Results of test for recovery(n＝5)

由表1可知:MT 的回收率为94.8%～104%,说明本方法的准确度较好。

2.7 干扰试验

试验考察了100倍的乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖和200 倍的Na＋、Zn2＋、NO3-、K＋、SO42-、Cl-对MT 测定结果的干扰。结果表明:以上物质均不干扰MT 的测定,所得相对误差均在±5%以内,说明p Er GO/GCE具有一定的抗干扰能力。

2.8 方法比对

和文献中相关方法进行了比对,结果见表2,其中MWCNT/GCE 为多壁碳纳米管(MWCNT)修饰的GCE。

表2 不同方法比对结果Tab.2 Comparison results of the different methods

表2 (续)

由表2可知:和其他方法相比,本方法所得的线性范围较窄,且浓度较低,检出限也较低,说明本方法适用于低浓度MT 的测定。

本工作建立了基于p Er GO/GCE 测定MT 含量的DPV 电化学法,该方法具有较低的检出限,较好重现性、再现性和准确度,并具有一定的抗干扰能力,可为较低浓度的MT 的测定提供技术参考。