基于功能核酸的纸基微流控芯片测定重金属离子的研究进展

郑玉竹,曹 慧,徐 斐,葛玉卿,王 震,陈莉敏,武薇薇,朱俊杰,袁 敏∗

(1.上海理工大学 医疗器械与食品学院,上海食品快速检测工程技术研究中心,上海 200093;2.中国科学院 上海微系统与信息技术研究所,上海 200050;3.上海皓信生物科技有限公司,上海 201109)

重金属对环境的污染日益严重,引起了严重的生态和全球公共卫生问题[1]。就毒性而言,最具危险性的重金属是铅、镉和汞等。镉在环境中的含量一般较低,不会影响人体健康,但会在生物体内富集,通过食物链对人体造成慢性中毒[2]。铅是水污染的主要来源之一,特别是在日常饮用水中,铅离子含量过高会导致严重的疾病,例如肾、肝和脑等器官疾病[3-4]。汞是一种广泛存在的环境毒物和污染物,会引起人体组织的严重改变,对健康产生不利影响[1]。另外,银离子具有杀菌消毒特性,但若其造成水污染或食品污染,通过食物链进入人体后会导致腹泻、神经或器官损伤等疾病[5]。因此,对水环境中重金属进行即时检测是非常有必要的,尤其是在经济较落后地区,水污染可能会更加严重,但很少引起人们的注意。

检测重金属离子广泛使用的方法有原子吸收光谱法(AAS)[6]、原子发射光谱法(AES)[7]、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)[8-9]和阳极溶出伏安法(ASV)[10]等。这些检测方法由于仪器体积大、价格昂贵、样品制备过程复杂,不可直接用于即时检测。上述常规检测方法还需要专业人员进行操作,这对于偏远、经济较落后地区来说很难解决。

功能核酸是指具有特定结构和功能的天然或人工核酸序列,其主要筛选方法是通过指数富集式配体系统进化技术在体外进行筛选。目前,功能核酸的相关研究不断深入,其被制作成生物传感器,已广泛应用于较多领域。李宸葳等[11]制备了铅离子功能核酸比色生物传感器,利用功能核酸特殊的催化性质实现了蛋白质、金属离子及小分子等的检测,进而达到治疗的目的。

随着微型化和集成化的发展,纸基微流控技术自2007年问世以来迅速发展[12],可用于健康诊断、环境监测和食品质量分析等诸多领域[12-13],特别是在环境分析领域显示出巨大的优势[14]。纸(纤维素纤维)作为微流控平台的基质,被称为纸基微流控芯片(μPADs)。μPADs通常以不同材料的纸为基材,运用喷蜡、喷墨印刷和平板印刷等技术制作而成。它的主要优点基于纸张的纤维结构,即允许液体在不使用外部或内部泵送系统的情况下自发流动[15];同时纸张的纤维结构还提供了内置的过滤能力,适用于处理复杂的样本,如血液。而微流控通道布局可以通过使用商业蜡打印机很容易地“打印”到纸上,从而形成疏水屏障[16]。此外,纸张基材价格低廉、储存容易、质量轻、运输方便。这种低成本的μPADs更适用于偏远、经济较落后地区以及临床检验。

尽管μPADs已推出10余年,但其作为传感器用于食品安全领域仍处于初级阶段。鉴于此,本工作综述了近年来应用不同类型的μPADs检测铅离子(Pb2＋)、镉离子(Cd2＋)、汞离子(Hg2＋)和银离子(Ag＋)等重金属的检测原理、检出限和应用情况;并对微流控芯片在纸基上应用的发展方向进行展望,希望能对食品或环境检测等相关领域的研究提供帮助。

1 μPADs检测重金属离子

1.1 铅离子

近年基于功能核酸的重金属离子传感器的研究取得了很大进展。使用μPADs检测铅离子的功能核酸根据作用机理主要分为两类:脱氧核糖核酸(DNA)酶和适体。

1.1.1 DNA酶方法

DNA 酶(也称催化脱氧核糖核酸)是指通过体外筛选方法获得的具有高效催化活性和结构鉴定能力的酶。DNA 酶由酶和底物链组成,基于DNA 酶的生物传感器具有多次翻转的特性,可以用于设计输出信号放大、荧光背景低的新型探针。但其底物易降解,成本比较高,而且由于DNA 酶的脆弱性,使用时所有溶液都需用焦碳酸二乙酯处理来创建无核糖核酸(RNA)酶的环境。

FU 等[17]基于DNA 酶及其良好的特异性,将DNA 酶放大传感技术与裂解诱导的G-四链体形成技术相结合,设计了无标记的DNA 酶荧光生物传感器,用于Pb2＋的放大“开启”荧光检测。无标记信号转导机制是基于锌(Ⅱ)原卟啉IX(ZnPPIX)荧光团与G-四链体结合前后的荧光输出不同,由靶诱导裂解产生和释放。此外,所有的DNA 酶都可以被释放以催化新一轮的反应,利用这一优势,少量的Pb2＋就可以显著增强荧光强度,因此检出限大大降低,低至3 nmol·L-1。同时,无标记的DNA 酶荧光生物传感器对干扰离子的选择性也很强。ZHU等[18]利用GR-5 DNA 酶对Pb2＋固有的特定性和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术来检测Pb2＋,该方法检测Pb2＋时在1～500 nmol·L-1内有良好的线性关系,检出限为0.7 nmol·L-1。YUN 等[19]基于DNA 酶分支结构,应用氧化石墨烯(GO)新型纳米材料设计出3 种DNA 酶传感器,同时检测Cu2＋、Pb2＋和Mg2＋的荧光检测方法。此方法是通过各条适体标记不同的荧光素来检测不同的金属离子,将酶链(E-DNA)和底物链(S-DNA)组成的3个荧光标记的DNA 序列退火,形成DNA 酶支链结构。该传感器对Pb2＋进行检测,检出限低至0.3 nmol·L-1,同时在1～500 nmol·L-1内有良好的线性关系。

但上述文献对Pb2＋的研究均是在溶液中进行的,相对于纸基上的应用而言,不够方便快捷。在未来的研究中可以考虑将其已经成熟的原理应用到纸基上,借助纸基自身的优势满足更高需求。

1.1.2 适体方法

适体是一种通过指数富集过程以及经济高效的配体系统进化合成的单链寡核苷酸,可折叠成特定的二级和三级结构。与特定目标结合,它们对不同的靶标具有高特异性亲和力。这些靶标包括相对分子质量较小的无机(如金属离子)/有机分子和相对分子质量较大的生物分子(如蛋白质)。与抗体相比,适体因具有较低的相对分子质量、出色的可持续性,以及易于修饰、无免疫原性等特征,可转化为优越的生物传感元件[20-25]。CHEN 等[26]采用改进的基于靶向诱导释放链的亲和层析法,以生物素标记的互补寡核苷酸为基础,在链霉亲和素包被的琼脂糖珠上结合单链DNA,成功分离了Pb2＋的适体。基于Pb2＋诱导配合物释放荧光标记的适体及其相应的猝灭标记的短互补序列,进一步设计了Pb2＋生物传感器,该生物传感器的动态线性范围为100～1 000 nmol·L-1。

而近几年,有一类富含鸟嘌呤(G)的DNA 序列引起了研究者的关注。运用此寡核苷酸设计的生物传感器通常是基于Pb2＋从富含G 的寡核苷酸序列中形成G-四链体结构的事实。根据阳离子配位会引起G-四链体结构和性质的变化,HE 等[27]以铱(Ⅲ)配合物作为G-四链体的特异性荧光探针,富含G 的DNA(PS2.M)作为Pb2＋的识别单元。在没有Pb2＋存在的情况下,PS2.M 以单链构象存在,铱(Ⅲ)探针与单链DNA 之间因弱结合而产生微弱的发光信号;在Pb2＋存在时,与Pb2＋发生结合,单链DNA 序列(PS2.M)被诱导成G-四链体构象,这增强了铱(Ⅲ)探针的发光强度,其详细的原理图如图1所示。上述新开发的无标记适体生物传感器,不需要昂贵的荧光标记寡核苷酸,且方法简单、快速,检出限低,灵敏度高。

图1 利用铱(Ⅲ)探针检测Pb2＋的原理图Fig.1 Schematic diagram of detection of Pb2＋with iridium(Ⅲ)probe

SUN 等[28]利用文献[27]的研究原理即无标记寡核苷酸的发光开启测定法检测Pb2＋,并作出一些改进。他们采用非常规原理设计了悬浮液滴模式μPADs,并经加热孵育和后续混合两步过程检测Pb2＋。此研究有两大突出亮点:一是选用了印刷杂志常用的美术纸;二是没有使用毛细力驱动传统纸质芯片上液体的流动,而是以润湿和重力作为驱动力,如图2所示。制备的微流控芯片将水样保持在离散的容器中,除非该芯片沿预定通道的方向倾斜,否则水滴不会移动。以此方式,施加到芯片上的液体样品将作为单独的液滴处理,并可根据需要进行储存、运输和混合。这样,芯片的使用者仅需要添加水来执行测定,使检测更加简单方便。检测结果显示,当Pb2＋的浓度为10～100 nmol·L-1时,与发射强度呈良好的线性关系,应用此方法检测水样中的Pb2＋,快速、方便,灵敏度高且成本低。

图2 芯片上Pb2＋离子检测的原理图Fig.2 Schematic diagram of detection of Pb2＋on chip

随着技术的进步,KHOSHBIN 等[29]利用Förster共振能量转移(FRET)工艺和GO 片材的超荧光猝灭特性设计了基于纸基的适体传感器。FRET 过程是指通过分子间的偶极-偶极相互作用,将供体激发态能量传递到近端基态受体的过程。试验将荧光蛋白、有机染料以及无机纳米结构的不同材料用作能量供体和受体荧光团,设计出基于FRET 的适体传感器。KHOSHBIN 等设计的纸基适体传感器的感测机制如图3所示。

由图3可见,基于Pb2＋特异性适体从无规线圈到G-四链体结构的构象转换,即在纸基平台上注射Pb2＋会诱导GO 表面释放特定的适体,从而恢复荧光发射。试验所开发的纸基适体传感器可在10 min内超灵敏地检测Pb2＋,检出限低至0.5 pmol·L-1。另外,研发的纸基适体传感器的应用范围也比较广泛,不仅可应用于环境水体中Pb2＋的检测,还成功应用于牛奶和人血清中Pb2＋的测定。

图3 纸基适体传感器与FRET 工艺相结合检测Pb2＋的原理图Fig.3 Schematic diagram of paper-based aptasensor combined with FRET process for Pb2＋detection

1.2 镉离子

目前,采用比色法检测金属离子的研究呈爆炸性增长[30-33]。结合比色法的μPADs具有成本低、检测快、易于携带及结果易于分辨等特点,可以满足大批量、短时间检测的需求[31]。例如,LÓPEZ等[32]开发了新的纸条,基于颜色变化,实现金纳米颗粒对Cd2＋的检测。在国内相关研究中,WANG等[33]选择金纳米团簇和乙二胺修饰的发光GO 作为构建多色荧光探针的材料,设计出对Cd2＋特异性响应的多色荧光纸质传感器,根据荧光颜色的改变,实现Cd2＋的可视化检测,并进一步利用智能手机识别荧光颜色的红、绿、蓝(RGB,三原色)值,发现Cd2＋的浓度与红色值与蓝色值的比值(R/B 值)呈线性关系,检出限为0.1μmol·L-1。

WANG 等[34]通过改良的指数富集的系统进化方法在体外筛选出了符合检测Cd2＋条件的适体。基于Cd2＋诱导的荧光标记的适体从具有猝灭剂的短互补序列的复合物中释放这一原理(图4)设计了一款生物传感器,以此来检测实际环境中的Cd2＋,检出限可低至40 nmol·L-1。

图4 用于检测Cd2＋的生物传感器的原理Fig.4 Principle of biosensor for detection of Cd2＋

ZHOU 等[35]首次在三维旋转μPADs平台上,以ZnSe量子点为荧光响应材料,并结合离子印迹技术设计了基于离子印迹聚合物的微流控量子点纸基芯片,其组装及检测过程见图5,该装置实现了对Cd2＋和Pb2＋的特异性、多重性检测。该研发团队选用毒性小、环境友好的ZnSe量子点,并通过将ZnSe量子点＠离子印迹聚合物的液相转移到固体玻璃纤维纸上,提高了器件的便携性。Cd2＋的线性响应范围为1～70μg·L-1,测定下限为0.245μg·L-1(4.98 nmol·L-1);Pb2＋的线性响应范围为1～60μg· L-1,测定下限为0.335μg · L-1(0.81 nmol·L-1)。与文献[33-34]相比,其对Cd2＋的检出限更低,并且对Cd2＋和Pb2＋均有良好的特异性;合成的离子印迹聚合物具有特定的识别位点,避免了其他离子的干扰。

图5 基于离子印迹聚合物的微流控量子点纸基芯片的组装和检测过程Fig.5 Assembling and detection process of QDs paper-based microfluidic chip based on ion imprinted polymer

ZHU 等[36]使用由Cd2＋特异性适体(CAP)组成的单标记多功能探针(CAP 作为Cd2＋的识别元件和信号报告器),建立了Cd2＋的荧光分析方法。这种策略只涉及适体探针,基于4个鸟嘌呤(G4)的猝灭剂避免了用荧光团/猝灭剂单元双重标记CAP。与其他核酸适体生物传感器相比,该方法更为简便、经济,检出限为2.15 nmol·L-1,远低于文献[34]报道的检出限。

上述技术具有操作简便、成本低、分析快速等优点,适用于食品中Cd2＋的现场筛查与检测。而传感器法因具有方便、自动化程度高、可现场检测等优点,有望能得到更好的发展[37]。

1.3 汞离子

基于检测溶液颜色变化的比色法检测Hg2＋的研究也有很多。如MEELAPSOM 等[38]采用烷基烯酮二聚体喷墨印刷制造μPADs,并掺杂未修饰的银纳米颗粒,由数字照相机和自制灯箱组成的设备来检测颜色强度。随着Hg2＋含量的增大,在μPADs上观察到的测试区域的颜色强度逐渐增加。该设备的线性范围为0.05～7 mg·L-1,检出限为0.001 mg·L-1。通常纳米材料的应用将线性范围限制在一个数量级,但该方法可以在更宽的范围(3个数量级)内检测Hg2＋。

目前,已经提出了多种基于荧光检测法的μPADs 方法来检测痕量重金属离子[39-44]。ZHANG 等[39]开发了μPADs,用荧光Cy5 标记的单链DNA 修饰GO 同时测定食品中不同类型的化学污染物,其原理如图6所示。结果表明,传感器在目标物存在下产生荧光,而在GO 表面则表现出Cy5的荧光猝灭。Hg2＋、Ag＋的检出限分别为121,47 nmol·L-1。BIAN 等[40]使用金纳米团簇试纸对Hg2＋和Pb2＋进行可回收检测,当Hg2＋存在时,观察到试纸荧光猝灭明显,而当存在Pb2＋时,观察到荧光增强显著。其中,Hg2＋和Pb2＋的检出限分别为5,50 mmol·L-1。QI等[41]基于Cd Te量子点的荧光猝灭,利用离子印迹技术制备了用于Cu2＋和Hg2＋多重检测的三维μPADs。结果表明,该装置对Cu2＋的线性响应范围为0.11～58.0 mg·L-1,检出限为0.035 mg·L-1;对Hg2＋的线性响应范围为0.26～34.0 mg·L-1,检出限为0.056 mg·L-1。

图6 利用单链DNA 功能化GO 传感器进行多重化学污染物检测的纸基微流控装置原理图Fig.6 Schematic diagram of the paper-based microfluidic device for detection of multiple chemical pollutants using single-stranded DNA functionalized GO sensor

陈绮娴等[45]将荧光碳纳米材料与纸芯片技术结合对Hg2＋进行高特异性检测。首先通过水热法制备了对Hg2＋具有高选择性的碳纳米材料,该纳米材料对Hg2＋的检测灵敏度可低至0.6μg·L-1,在0.04 mg·L-1以内和0.6～10 mg·L-1内表现出良好的线性响应。然后,选择Whatman 4号滤纸作为打印基底,利用常规喷墨打印机将所制备的新型碳纳米材料固载于纸芯片材料上,构建了可用于Hg2＋快速检测的纸芯片检测条带。邓大庆等[46]提出一种实时荧光定量PCR 技术与T-Hg2＋-T 特异性相结合来检测Hg2＋的方法,利用实时荧光定量PCR对模板DNA 的特异性扩增产生的荧光信号作为检测信号。该传感体系中Hg2＋的线性范围为0.05～100 nmol·L-1,检出限低至30 pmol·L-1。

1.4 银离子

吴雪琪等[47]基于核酸适配体错配结合Ag＋的原理,利用DNA 探针和GO 设计开发了C-Ag＋-C和GO 结合的新型荧光传感器,可用于特异性检测Ag＋。此传感器检测Ag＋的线性范围为150～400 nmol·L-1,检出限为23 nmol·L-1。与使用GO 检测重金属离子的方法相比,该法的检测线性范围更宽。ZHU 等[48]建立了一种通过荧光猝灭法检测Ag＋的新方法。此方法通过Ag＋特异性诱导多功能适配体探针发生分子折叠,形成稳定的茎环结构,使G4 碱基靠近荧光基团6-羧基荧光素(FAM),发生荧光共振能量转移,从而导致荧光猝灭。方法的检出限可低至0.64 nmol·L-1。

XIAO 等[49]开发了一种用于检测Ag＋的增强型3D 纸基生物传感装置,该装置需使用具有高灵敏度和便携性的个人血糖仪。在该装置中,3D 折纸μPADs集成了一块载药纳米多孔膜[即载有3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)的亲水性聚碳酸酯纳米多孔膜(NM)],膜结合分析物后触发银纳米粒子的自生长,原位阻断膜孔,并利用手持个人血糖仪有效地放大信号。具体μPADs结构如图7 所示。该装置可检测自来水、饮用水、池塘水、土壤水等实际水样中Ag＋的含量,其检出限为58.1 pmol·L-1。

图7 3D折纸NM-μPADs和用2个夹子固定的3D NM-μPADs图像Fig.7 Images of 3D origami NM-μPADs and 3D NM-μPADs fixed with two clips

KHOSHBIN 等[50]不仅通过μPADs检测了Pb2＋,还开发了一种基于纳米材料GO 的适体传感器,用于同时检测Ag＋和Hg2＋。传感阵列的原理是将目标金属离子Hg2＋和Ag＋注入传感平台,引发适体发生构象变化,从而使适体从GO 表面释放出来,如图8所示。适体携带金属离子释放出来,金属离子浓度发生变化,进而引起荧光强度的变化。该适体传感器使Hg2＋和Ag＋的检出限低至1.33,1.01 pmol·L-1。与已报道的适体方法相比,此适体传感器在痕量分析中具有卓越的性能。

图8 纸基适体传感器同时检测Ag＋和Hg2＋的原理图Fig.8 Schematic diagram of paper-based aptamer sensor for the simultaneous detection of Ag＋and Hg2＋

2 总结及展望

纸基微流体分析装置代表了新一代的诊断装置,它将相对发达的多重能力的微流体与灵活、简单的横向流动试验条技术相结合,可为终端消费者提供一种用户友好、成本效益高、便携式的诊断工具。目前该技术存在材料昂贵、工艺复杂、难以大规模制造等问题。优良的μPADs的制作方法还需进一步研究,需要具备低成本的操作流程、廉价的制造技术和简单易用的平台解决方案等条件。

尽管已经进行了较多概念的演示以及方案的研究,但μPADs目前仍处于初级阶段,这也意味着纸基微流控分析装置在全球健康等领域具有巨大的潜力和广阔的应用前景。μPADs可通过印刷和表面化学在纸上进行整合,未来的纸基芯片将能够执行多种功能,如分离、纯化、浓缩、合成等。纳米材料已成功用于构建各种新型生物传感器[51-53],而具有良好特性的纳米技术将对提高下一代纸基微流控器件的灵敏度和选择性有着巨大的影响。同时,免疫学、遗传学和电子学也可以与纸质微流体结合,促进纸基芯片的多样性发展。