基于肝素-丙二醇酯的新型磁共振对比剂用于小鼠肿瘤成像

郑钦允，聂 蕾，侯若莹，唐文英，张体江

(遵义医科大学附属医院影像科 贵州省医学影像中心，贵州 遵义 563003)

肿瘤MR增强成像一直是临床关注重点[1]，其强化特点有助于鉴别不同类型肿瘤，并判断其良恶性[2-3]。目前临床常用MR对比剂主要为小分子钆(Gd3+)对比剂，如钆喷酸葡胺(DTPA-Gd)、钆特酸葡甲胺(DOTA-Gd)等，存在靶向性较差、组织对比度欠佳和成像窗口时间较短等缺陷[4-6]，欲达到理想成像效果，需要采用较高注射剂量和流率，易致Gd3+滞留，增加毒副作用如肾源性系统性纤维化和脑内Gd3+沉积等风险[7-9]。因此，研发组织对比度更高、靶向性更强、成像窗口时间更长且毒性较低的新型MR对比剂已经成为当前国内外MR肿瘤成像的重要研究方向之一[10-11]。本研究观察基于肝素-丙二醇酯的新型MR对比剂Gd-PPF-SS-CA用于小鼠皮下瘤成像的价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料 4T1细胞取自小鼠乳腺癌细胞系(购自上海生命科学研究院)，经两次传代后用于建立肿瘤模型。20只8～10周健康雌性BALB/c小鼠(购自成都达硕实验动物有限公司)，体质量(20±2)g。将4T1细胞接种于10只小鼠背部皮下，接种细胞量为7×105个，待1周后肿瘤体积达到100 mm3时用于在体MR成像。Gd-PPF-SS-CA(Gd3+浓度为6.48 g/L)由四川大学生物材料学院合成，以PPF为载体，通过可逆加成-断裂链转移聚合反应引入一个酶敏感的短肽(GFLG)于其内，再通过点击反应将DOTA-Gd和还原敏感的二硫键分别连接于载体材料的侧链而最终制得。DTPA-Gd购自瑞禧生物公司。本研究获得四川大学动物伦理委员会批准。

1.2 体外测定弛豫率 将Gd-PPF-SS-CA和DTPA-Gd配成不同Gd3+浓度(0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35，0.40 mmol/L)制剂。以GE 3.0T Architect MR扫描仪对其行常规自旋回波(spin echo, SE)序列T1W扫描，参数： TE 8.7 ms，TR 20、30、50、70、90、125、150、175、200、300、400、500、700、850 和1 000 ms，FOV 200 mm×200 mm，层厚2.0 mm，矩阵256×256。在后处理工作站对图像进行圈值，获得相应1/T1值，根据1/T1与Gd3+浓度之间的线性关系斜率得出两种MR对比剂的纵向弛豫率(r1)值。

1.3 在体MR检查 将10只荷瘤雌性BALB/c小鼠随机分成实验组和对照组，每组5只，分别以Gd-PPF-SS-CA和DTPA-Gd为对比剂，以配备小鼠线圈的临床GE 3.0T Architect MR仪行平扫及增强MR扫描。先使用异氟烷气体麻醉小鼠，对肿瘤部位采集平扫SE-T1WI，TR 400 ms，TE 14 ms，FOV 60 mm×60 mm，体素0.2 mm×0.2 mm×1.5 mm，层数12，层间距1.2 mm，获得注射前信号强度(signal intensity, SI)。之后按照0.08 mmol Gd/kg体质量经尾静脉注射对比剂，并分别于注射完后10 min、0.5 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h及8.0 h采集图像及相对器官SI，与注射前比较获得注射前后信号变化值(SI%)。

1.4 Gd-PPF-SS-CA在体急性毒性作用 将10只健康小鼠随机分为Gd-PPF-SS-CA组与生理盐水组各5只，分别静脉注射0.08 mmol Gd/kg体质量或同等量生理盐水。24 h后解剖动物，取出心、肝、脾、肺、肾等主要脏器用于病理组织分析，观察Gd-PPF-SS-CA在体急性毒性作用。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0统计分析软件。采用方差分析和t检验比较各组间体外弛豫率磁共振SI和体内肿瘤部位强化程度差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外弛豫率 Gd-PPF-SS-CA的SI%高于DTPA-Gd(248% vs 132%，F=9.87，P<0.05)，r1分别为12.87 L/(mmol·s)和3.51 L/(mmol·s)，前者为后者的3.67倍，见图1。

图1 体外纵向弛豫率比较 A.T1WI； B.r1

2.2 在体肿瘤部位成像 实验组注射对比剂后肿瘤部位SI逐渐增加，注射后10 min～2 h内持续增强，2 h时达强化峰值(图2)，随后强化程度下降，8 h仍可见强化；对照组肿瘤有效成像窗口时间仅0.5 h(图2)。实验组最大增强幅度为128.43%，高于对照组的48.20%(t=0.0015，P<0.05，图3)。

图2 2组肿瘤T1WI比较

图3 2组肿瘤部位SI%(*：P<0.05)

2.3 Gd-PPF-SS-CA在体急性毒性作用 静脉注射0.08 mmol Gd/kg体质量及同等量生理盐水后24 h内小鼠均未表现出明显急性毒副作用(如出血、运动共济失调、死亡等)。处死、解剖后观察，Gd-PPF-SS-CA组与生理盐水组均未见明显组织损伤和组织病理学异常如炎症、坏死、萎缩及组织变形等。见图4。

图4 组织病理学观察Gd-PPF-SS-CA在体急性毒性 A.注射生理盐水(HE，×10)； B.注射生理盐水(HE，×20)； C.注射Gd-PPF-SS-CA(HE，×10)； D.注射Gd-PPF-SS-CA(HE，×20)

3 讨论

本研究以聚肝素-丙二醇酯(poly-heparin propanediol ester, PPF)大分子为载体，通过化学键将小分子Gd3+螯合物与其连接，并在主链结构中引入二硫键，使其可被谷胱甘肽降解，以实现在肿瘤高靶向、高对比和长时间成像的同时迅速释放小分子Gd3+螯合物，从而显著降低直至避免Gd3+滞留所带来的潜在毒性风险，提高其安全性。

3.1 体外弛豫率分析 弛豫率决定着MR对比剂的增强效果。高弛豫率MR对比剂应具有能与大量水分子配位结合的顺磁性物质、较短的水相抵抗时间和相对慢的旋转速率，故既往研究[12]多从上述方面入手，以提高对比剂的弛豫率。聚合物对比剂的弛豫率与分子量、分子大小及其结构密切相关[13]。本研究重点加大Gd-PPF-SS-CA的分子量，增加其分子径线，有利于降低其分子旋转运动、提高旋转相关时间，进而提升材料中Gd3+与水分子的交换时间和速率，最终使Gd-PPF-SS-CA纵向弛豫率(r1)大幅增加。

3.2 体内肿瘤成像 量化分析实验组与对照组肿瘤MRI，发现Gd-PPF-SS-CA对肿瘤MRI信号的最高增幅达128.43%，约为相同条件下DTPA-Gd(48.20%)的2.66倍。分析原因，Gd-PPF-SS-CA体外弛豫效能远高于DTPA-Gd，其分子量更大，能更有效地通过高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect)而高度聚集于肿瘤组织，增强效果更为显著。此外，Gd-PPF-SS-CA强化持续时间长，肿瘤组织中富含大量谷胱甘肽，Gd-PPF-SS-CA只能通过主链上的谷胱甘肽降解、断裂来释放含小分子Gd3+螯合物的低分子量片段，降解后产物的分子量和径线均较大，排出肿瘤细胞缓慢，导致信号下降缓慢；而DTPA-Gd为小分子结构，弛豫效能低，代谢速率较快，故成像效果和成像窗口时间均低于Gd-PPF-SS-CA。

3.3 材料毒性分析 电正性大分子进入体内易被荷负电的蛋白或红细胞所吸附，进而产生体内应激急性反应，如炎症或溶血等。本研究静脉注射Gd-PPF-SS-CA 24 h后观察，小鼠主要脏器均未见异常表现，表明Gd-PPF-SS-CA的生物相容性良好。

综上所述， Gd-PPF-SS-CA作为MR对比剂具有优异的弛豫效能，能够提高肿瘤对比度，且可在保证成像效果的同时利用材料结构本身的降解特性实现体内迅速代谢，以明显降低甚至避免Gd3+滞留所致毒副反应。