补肾活血方对原发性免疫性血小板减少症小鼠肠道免疫及淋巴细胞周期的影响

秦兰 刘晓 李巍 费飞

摘要 目的：通过研究补肾活血方对原发性免疫性血小板减少症（ITP）模型小鼠免疫系统的影响，探讨补肾活血方治疗ITP的效果及作用机制。方法：建立ITP小鼠模型，ELISA法检测小鼠肠黏液中免疫球蛋白的含量及小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞P53蛋白表达的变化;流式细胞仪检测小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞周期及淋巴细胞凋亡率的变化。结果：补肾活血方能够显著下调小鼠肠黏液中免疫球蛋白含量（P<0.05）;下调P53蛋白表达，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01）;显著升高G0/G1期淋巴细胞比例（P<0.05），降低S期淋巴细胞比例（P<0.05），降低淋巴细胞凋亡率（P<0.05），对淋巴细胞周期异常分布及异常凋亡有一定的改善作用。结论：补肾活血方对ITP小鼠有明显的治疗作用，其作用机制主要表现为下调ITP小鼠IgG、SIgA含量及淋巴细胞P53蛋白表达、改善ITP小鼠淋巴细胞周期异常分布、降低淋巴细胞凋亡率等，其具体机制有待进一步的研究探索。

关键词 原发性免疫性血小板减少症;小鼠免疫球蛋白;P53蛋白;淋巴细胞周期;淋巴细胞凋亡率;中药复方;肠道免疫;ITP小鼠模型

Effect of Bushen Huoxue Decoction on Intestinal Immunity and Lymphocyte in ITP Mice

QIN Lan，LIU Xiao，LI Wei，FEI Fei

（Hematology Department of the Fourth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，China）

Abstract Objective：To investigate the effect and mechanism of Bushen Huoxue Decoction by studying the effect of Bushen Huoxue Decoction on ITP.Methods：the immune ITP model was established.The contents of immunoglobulin in intestinal mucus and the changes of P53 protein expression in mouse mesenteric lymph node lymphocytes were detected by ELISA.The changes of lymphocyte cycle and apoptosis rate in mesenteric lymph node were detected by flow cytometry.Results：Bushen Huoxue Decoction can significantly reduce the content of immunoglobulin in intestinal mucus of mice （P<0.05）.The expression of P53 protein decreased，which was significantly different from the model group （P<0.01）.The proportion of lymphocytes in G0/G1 stage significantly increased （P<0.05），the proportion of lymphocytes in S stage decreased （P<0.05），and the apoptosis rate of lymphocytes reduced （P<0.05），which indicated Bushen Huo xue Decoction was effective on the distribution of lymphocyte cycle and apoptosis.Conclusion：Bushen Huoxue Decoction has obvious therapeutic effect on ITP mice，the main mechanism of which is manifested on the down-regulation on the IgG and SIgA content of ITP mice and the expression of lymphocyte P53 protein，improvement of the distribution of lymphocyte cycle in ITP mice and reduction the apoptosis rate of lymphocyte，etc.The specific mechanism needs to be further explored.

Keywords Primary lmmune thrombocytopenia; Mouse immunoglobulin; P53 protein; Lymphocyte cycle; Apoptosis rate of lymphocytes; Chinese compound; Intestinal immunity; ITP mouse model

中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.012

原发性免疫性血小板减少症（Primary Immune Thrombocytopenia，ITP）是一种常见的出血性疾病，主要临床表现为皮肤黏膜出血，皮肤瘀点、瘀斑，可能伴有牙龈出血、鼻衄，严重者甚至会出现内脏及颅内出血[1]。ITP发病机制尚未完全明确，主要原因可能与免疫功能失调有关[2]。本实验通过观察补肾活血方对ITP模型小鼠肠黏液中免疫球蛋白的含量的变化、肠系膜淋巴结淋巴细胞周期的变化、淋巴细胞P53蛋白表达及淋巴细胞凋亡率的影响，探讨补肾活血方治疗对ITP小鼠免疫系统的作用效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 BALB/C小鼠，雌雄比例1∶1，平均体重（18±2）g，SPF级;购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2007-00058。动物饲养和实验均在SPF级动物实验室内进行。环境温度（22±2）℃，湿度40%～70%，光照12 h/12 h明暗交替环境，正常饮食。所有操作均严格按照中国伦理委员会有关动物研究指导原则进行（动物伦理审批号：XJMULA201903）。

1.1.2 药物 补肾活血浸膏：制备方法：黄芪、生地黄、熟地黄、补骨脂、巴戟天、淫羊藿、山药、山萸肉、龟甲胶、丹参、川芎、菟丝子、三七、鸡血藤、女贞子、墨旱莲、甘草，均由新疆医科大学第四附属医院提供，使用煎煮法提取至浓度为1.5 g/mL的补肾活血浸膏，备用。醋酸泼尼松片（浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字H33021207）。

1.1.3 试剂与仪器 主要试剂：胎牛血清（GIBCO，美国，批号：16000-044）;抗生素（青链霉素）（GIBCO，美国，批号：15140-122）;DMEM培养基（GIBCO，美国，批号：C11965500BT）;胰蛋白酶（GIBCO，美国，批号：25200-056）;PI碘化丙啶（Sigma公司，美国，批号：P4170）。主要仪器：移液器（EPPendorf公司，德国，型号：Researchplus）;CO2恒温培养箱（Sanyo公司，日本，型号：MCO-20AIC）;超净工作台（Baker公司，美國，型号：BioChem GARD e3）;电热恒温水箱（上海跃进医疗器械公司，型号：HH·W21·600S）;倒置显微镜（OLYMPUS公司，日本，型号：IX53）;血球计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司，型号：101010）;流式细胞仪（BD公司，美国，型号：BD Biosciences FACSCalibur）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 1）分组：实验前从168只小鼠尾静脉取血，用全自动血细胞计数仪检测血小板数，按照血小板计数随机分组，共随机分为6组，每组24只小鼠。分别为正常组、模型组、阳性药物泼尼松组、补肾活血高剂量组、补肾活血中剂量组和补肾活血低剂量组。2）ITP模型建立：使用BALB/C小鼠建立免疫性ITP小鼠模型（豚鼠抗小鼠血小板血清APS注射法），造模12、24、48 h后分别取小鼠尾静脉血做血小板检测观察结果。使血小板在7 d内维持原水平的30%左右，造成小鼠慢性持续性血小板减少ITP模型，造模8 d后开始给药。

1.2.2 给药方法 将168只小鼠随机分为6组，每组24只。阳性药物泼尼松组给药剂量为0.2 mL/10 g;补肾活血高剂量组给药剂量为0.4 mL/10 g;补肾活血中剂量组给药剂量为0.2 mL/10 g;补肾活血低剂量组给药剂量为0.1 mL/10 g;正常组、模型组分别给予药物等体积的生理盐水，造模8 d后每日灌胃1次，连续给药14 d。

1.2.3 检测指标与方法 实验结束后，处死小鼠，取小肠组织，制备匀浆，ELISA法检测小鼠肠黏液中免疫球蛋白的含量的变化;FCM技术观察小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞周期的变化;ELISA法检测小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞P53蛋白表达;TUNEL法检测小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡率。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用方差齐性检验和q检验，多组比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 补肾活血方对ITP小鼠肠黏液中免疫球蛋白含量的影响 模型组lgG、SlgA都明显高于正常组（P<0.01），泼尼松组lgG、SlgA与模型组比较均显著降低（P<0.01），补肾活血高、中剂量组lgG、SlgA与模型组比较均显著降低（P<0.05），说明补肾活血方能够显著下调小鼠肠黏液中免疫球蛋白含量。见表1。

2.2 补肾活血方对ITP小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞周期的影响 模型组G0/G1期淋巴细胞比例明显低于正常组（P<0.05），G2/M期与S期淋巴细胞比例都明显高于正常组（P<0.05），给药后泼尼松组与模型组比较G0/G1期淋巴细胞比例有所升高，S期淋巴细胞比例与模型组比较有所降低，差异均有统计学意义（P<0.05），补肾活血高剂量组与泼尼松组作用类似，与模型组比较，G0/G1期淋巴细胞比例显著升高（P<0.05），S期淋巴细胞比例与模型组比较显著降低（P<0.05）。G2/M期淋巴细胞比例低于模型组，但差异无统计学意义。补肾活血中、低剂量组与模型组比较虽差异无统计学意义，但可以看出与高剂量组变化趋势相同。说明补肾活血方治疗后G0/G1期淋巴细胞比例有所提高，而G2/M期与S期淋巴细胞比例有所下降，虽没有恢复到正常组水平，但补肾活血方给药后对淋巴细胞周期分布有一定的改善作用。见表2。

2.3 补肾活血方对ITP小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞P53蛋白表达的影响 模型组P53蛋白表达明显高于正常组（P<0.01），药物干预后泼尼松组P53蛋白表达显著低于模型组（P<0.01），虽没有达到正常组水平，但P53蛋白表达下调明显。补肾活血高剂量组P53蛋白表达与模型组比较显著降低（P<0.01），高剂量组与泼尼松组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。补肾活血中、低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05），但P53蛋白表达较模型组有所下调，更接近正常组。说明补肾活血方给药后能够下调鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞P53蛋白表达。见表3。

2.4 补肾活血方对ITP小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡率的影响 模型组小鼠肠系膜淋巴细胞凋亡率明显高于正常组（P<0.01），泼尼松给药后细胞凋亡率较模型组明显下降（P<0.01），补肾活血高剂量组与模型组比较淋巴细胞凋亡率也有所下降（P<0.05），补肾活血中剂量组、低剂量组细胞凋亡率与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05），但细胞凋亡率也有所下降。说明补肾活血方给药后能够降低淋巴细胞凋亡率。见表4。

3 讨论

ITP中医学统称为“紫癜病”，中医学认为ITP的病机主要与脾、肾相关[3]，故而治疗以“健脾补肾”为主，配合活血祛瘀法的治疗方法在临床上已经取得了一定的疗效[4-5]。补肾活血方以多年临床经验为基础，以“补肾活血”为治疗原则，以黄芪、生地黄、熟地黄、补骨脂、巴戟天、淫羊藿、山药、山萸肉、龟甲胶、丹参、川芎、菟丝子等药物配伍，总结出补肾活血方，具有改善患者外周血小板数量、缓解出血症状的作用[6]。由于ITP的发病机制与自身免疫密切相关，当ITP发病后，免疫系统表现为紊乱状态，相关细胞因子异常分泌、T细胞亚群发生变化，导致免疫球蛋白异常、骨髓巨核细胞增殖异常等等[7-9]。补肾活血方在临床上对ITP有良好的治疗作用，故本实验主要探究补肾活血方对ITP小鼠免疫功能的影响。

免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）、分泌型免疫球蛋白A（Secretory Immunoglobulin A，SIgA）是血清抗体的主要成分。ITP发病机制与自身免疫密切相关，ITP患者血液中的IgG、SIgA均有异常升高的现象[10]。本实验结果与之相符，ITP模型组小鼠与正常组比较，IgG、SIgA均显著升高，补肾活血方给药后ITP小鼠IgG、SIgA含量均有所下降，结果与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），说明补肾活血方能够缓解ITP小鼠IgG、SIgA含量異常升高。

P53蛋白是一种转录因子，控制细胞核内基因的转录，参与多种细胞应激反应，P53蛋白也与免疫系统密切相关，下调P53蛋白能够促进淋巴细胞的增殖[11]。本实验中，ITP小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞P53蛋白表达与正常小鼠比较明显升高，药物干预后补肾活血高剂量组小鼠淋巴细胞P53蛋白表达与模型组比较显著降低，补肾活血中、低剂量组与模型组比较差异无统计学意义，但P53蛋白表达较模型组也有所下调，更接近正常组，说明补肾活血方能够下调P53蛋白异常表达，改善ITP小鼠症状。

细胞周期可分为G1期、G2期、S期及M期，其中相对静止状态的G0/G1期为DNA合成前期，S期为DNA合成期，G2期为DNA合成后期，M期为有丝分裂期。正常人淋巴细胞处于G0/G1期为主，S期及G2/M期细胞较少，而ITP患者淋巴细胞G0/G1期比例较低，而处于S期及G2/M期淋巴细胞比例较高，说明ITP患者淋巴细胞存在周期分布异常[12]。本实验结果与这一现象相符，补肾活血方干预后，ITP小鼠淋巴细胞处于G0/G1期比例显著升高，S期淋巴细胞比例与模型组比较显著降低。G2/M期淋巴细胞低于模型组，但差异无统计学意义，说明补肾活血方能够改善ITP小鼠淋巴细胞周期分布异常。另外，通过淋巴细胞凋亡率检测，补肾活血方能够明显减低淋巴细胞凋亡率。说明补肾活血方能够改善ITP小鼠淋巴细胞周期异常分布，降低淋巴细胞凋亡率。

综上所述，补肾活血方对ITP小鼠有明显的治疗作用，其作用机制主要表现为下调ITP小鼠IgG、SIgA含量及淋巴细胞P53蛋白表达、改善ITP小鼠淋巴细胞周期异常分布、降低淋巴细胞凋亡率等，其具体机制有待进一步的研究探索。

参考文献

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（2019-08-31收稿 责任编辑：苍宁）