基于网络药理学的中药复方知柏地黄丸治疗代谢综合征的机制研究

李嘉鑫 李慧 刘思佳 孟宪悦 李艳春 杨宇峰 石岩 张丹

摘要 目的：應用网络药理学的研究方法挖掘中药复方知柏地黄丸治疗代谢综合征的物质基础及其作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库检索中药复方知柏地黄丸中八味中药的主要活性成分，并进行靶点预测。通过OMIM、TTD、DisGeNET数据库检索代谢综合征的相关靶点，将中药靶点与疾病靶点取交集得到共同作用靶点。应用STRING平台构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，通过Cytoscape软件对其进行拓扑学分析筛选出核心靶点。最后，基于Metascape软件并进行GO-BP生物功能富集和KEGG通路分析。结果：经数据库分析中药复方知柏地黄丸中含有活性化合物74个，作用靶点906个，其中290个为与代谢综合征共有靶点;通过对共有靶点的拓扑分析，筛选出核心靶点78个，GO-BP生物功能富集以及KEGG通路分析发现，其可通过循环系统、G蛋白偶联受体信号通路、脂多糖调节、调控血压、脂质代谢调节等多种生物学功能以及血管内皮生长因子信号通路、钙信号通路、ErbB信号通路等多条代谢通路发挥其治疗作用。结论：中药复方知柏地黄丸可通过过氧化物酶体增殖激活受体（PPAR）、转录激活因子-3（STAT3）、磷脂酰肌醇激酶（PIK3）等靶点经过循环系统、G蛋白偶联受体信号通路、与环状核苷酸第二信使偶联以及VEGF信号通路、钙信号通路、ErbB信号通路等代谢通路发挥治疗代谢综合征的作用，为其临床和基础研究提供新的科学依据。

关键词 中药复方;知柏地黄丸;网络药理学;靶点预测

Study on the Mechanism of Chinese Medicine Zhibai Dihuang Pill in the Treatment of Metabolic Syndrome Based on Network Pharmacology

LI Jiaxin，LI Hui，LIU Sijia，MENG Xianyue，LI Yanchun，YANG Yufeng，SHI Yan，ZHANG Dan

（Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China）

Abstract Objective：To explore the material basis and mechanism of Chinese compound Zhibai Dihuang Pill in the treatment of metabolic syndrome by the application of network pharmacology research methods.Methods：Through the Chinese Medicine System Pharmacology Technology Platform （TCMSP） database，the main active components of traditional Chinese medicine compound Rhizoma Anemarrhenae，Cortex Phellodendri，Radix Rehmanniae Preparata，Fructus Corni，Rhizoma Dioscoreae，Cortex Moutan Radicis，Rhizoma Alismatis were retrieved and made for target prediction.The OMIM，TTD，and DisGeNET databases were used to retrieve the relevant disease targets of the metabolic syndrome，and the eight-flavored Chinese medicine target was intersected with the disease target to screen for a common target.The STRING platform was used to construct a protein-protein interaction（PPI） network model，and the network was topologically analyzed by using Cytoscape software to obtain the core target.GO-BP biofunctional enrichment analysis and KEGG pathway analysis were performed on the core targets by Metascape software.Results：By database analysis，it was inferred that the database of Chinese medicine compound Zhibai Dihuang Pill contained 74 active compounds，906 target sites，and 290 targets shared with metabolic syndrome.Through the topological analysis of common targets，the core of Chinese medicine compound Zhibai Dihuang Pill was screened for 78 target.From GO-BP biological function enrichment and KEGG pathway analysis，it was found that through the circulatory system，G protein coupled receptor signaling pathway，lipopolysaccharide regulation，regulation of blood pressure，lipid metabolism regulation and other biological functions，and a variety of metabolic pathways such as calcium signaling pathway，VEGF signaling pathway and ErbB signaling pathway they played a therapeutic role.Conclusion：This study explored the material basis and mechanism of Chinese medicine compound Zhibai Dihuang Pill in the treatment of metabolic syndrome，and provided a new scientific basis for its clinical and basic research.

Keywords Traditional medicine compound; Zhibai Dihuang Pill; Network pharmacology; Target prediction

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.005

代谢综合征（Metabolic Syndrome，MS）这一疾病概念最早由Reaven提出，指人体的蛋白质、脂肪、碳水化合物等物质发生代谢紊乱的一组复杂综合征，同时也是导致糖尿病和心脑血管疾病的重要危险因素。世界卫生组织于1998将其定义为机体出现胰岛素抵抗并伴有肥胖、高脂血症、高血压、微量蛋白尿等任意2个及以上危险因素[1]。因此MS又称为X综合征、高三酰甘油血症等。随着经济的不断发展和现代人生活水平的提高，代谢综合征的发病率也不断增加，且越来越受到医生的重视。2005年国际糖尿病联盟（IDF）估计全球约有1/4人口患有代谢综合征[2]。根据一项在我国的调查数据显示，60岁以上的人群中58.1%患有MS，且北方明显高于南方[3]。中医认为先天禀赋不足、过食肥甘厚味、劳逸过度、情志失调等皆可导致本病的发生，其总病机为本虚标实、虚实夹杂。中医治疗MS则根据其不同的证候表现进行辨证论治，大多采用攻补兼施的方法。中药复方知柏地黄丸由知母、黄柏、熟地黄等八味中药组成，在临床上主要用于治疗阴虚火旺之证。《医方考》卷5原名六味地黄丸加黄柏知母方[4]，原治肾劳，背难俯仰，小便不利，有余沥，囊湿生疮，小腹里急，便赤黄者。

中药复方治疗疾病具有多成分、多靶点、多环节的协调作用，方剂配伍更是遵循“君、臣、佐、使”的配伍原则。网络药理学则是通过多学科的交叉应用以及整体生物网络的分析与再整合，从预测和辨识中药复方的作用靶点、阐明作用机制、科学解释组方规律、发现新的适应证及与组学技术结合应用等多个方面，构建多层次的网络模型，从整体角度对中药复方进行研究[5-6]。其运用先进的科学技术及国际通用的科学语言，对抽象的中医药理论加以诠释，阐明中药复方的有效性和科学性，使之与现代医学相接轨，符合中医药现代化的发展需要。我们应用网络药理学技术探索知柏地黄丸治疗MS的作用靶点及其机制，为其今后的临床和基础研究提供新的科学依据。

1 材料与方法

1.1 中药成分及靶点的獲取

分别以中药复方知柏地黄丸中8味中药作为检索词在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp）进行检索[7]，并以口服吸收率（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18和半衰期（HL）≥4 h作为筛选条件，获得知柏地黄丸的主要成分。然后通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到Smiles格式，最后利用Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstarget-prediction.ch/），得到中药成分的作用靶点。并利用Uniprot数据库（http：//www.uniprot.org/）对其进行标准化处理，从而挖掘黄柏、知母、熟地黄、山茱萸、山药、牡丹皮、茯苓、泽泻8味中药的成分和作用靶点。

1.2 疾病靶点的筛选

在OMIM（http：//www.omim.org/）、TTD（http：//www.genecards.org/）、DisGeNET（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu）数据库中，分别搜索疾病关键词为代谢综合征（Metabolic Syndrome），合并检索结果并去除重复值，筛选出MS的疾病靶点。

1.3 中药-疾病靶点网络构建及核心靶点的筛选

应用Venny（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）将中药复方知柏地黄丸中八味中药的作用靶点与MS的疾病靶点取交集，筛选出中药-疾病共同含有的靶点，绘制韦恩图。在String平台（https：//string-db.org/）构建共有靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，其中种类为“Homo sapiens”，“highest confidence>0.9”，获得PPI网络图同时保存csv.格式文件。并应用Cytoscape软件中“Network Analyzer”模块对该文件中node1、node2和Combined score信息进行可视化分析，筛选“节点度值分布（Degree）和介数中心性（Betweenness Centrality）”同时在中位数以上的作为“核心靶点”。Degree和Betweenness Centrality的值与节点重要性成正比。

1.4 生物功能注释及通路分析

为挖掘其在治疗MS方面的作用机制，利用Metascape[8]（http：//metascape.org/）对上述筛选出的靶点进行GO-BP富集分析和KEGG通路分析。最后绘制核心靶点-KEGG信号通路-GO-BP生物功能相互作用网络图。

2 结果

2.1 中药复方主要成分及靶点的筛选

通过在TCMSP中检索中药的成分和对其的进一步筛选，分别得到主要成分黄柏27个、山茱萸16个、山药16个、茯苓14个、知母14个、泽泻10个、牡丹皮9个、熟地黄2个，删去重复值共得到主要化学成分74个。通过Swiss Target Prediction数据库，得到化学成分的作用靶点山茱萸605个、黄柏503个、知母381个、泽泻321个、茯苓250个、山药220个、牡丹皮185个、熟地黄47个，去除重复靶点共得到905个作用靶点。

2.2 中药复方与疾病共同靶点的筛选

基于OMIM数据库、TTD数据库与DisGeNET数据库对MS的疾病靶点进行检索、筛选，共获得靶点883个。将中药复方知柏地黄丸靶点与MS疾病靶点输入Venny 2.1软件绘制韦恩图。见图1。二者取交集后获得MS与中药复方知柏地黄丸共有靶点290个。

2.3 PPI网络与核心靶点分析

利用String对上述得到的中药复方知柏地黄丸与MS共同作用靶点绘制PPI网络图。见图2。应用Cytoscape软件对网络中所有点的进行分析和筛选，共得到中药复方知柏地黄丸78个核心靶点。即：过氧化物酶体增殖激活受体（PPAR）、磷脂酰肌醇激酶（PIK3）、转录激活因子-3（STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、表皮生长因子受体（EGFR）、血管内皮生长因子A（VEG-FA）、维A酸类受体α（RXRA）、尿激酶型纤溶酶原激活蛋白（PLAU）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、纤溶酶原（PLG）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、白细胞介素-2（IL-2）、丝氨酸/苏氨酸激酶2（AKT2）、激酶插入区域受体（KDR）等等。

2.4 核心靶点生物功能富集分析

GO-BP生物学功能富集分析结果显示中药复方知柏地黄丸主要通过循环系统（Circulatory System Process）、G蛋白偶联受体信号通路（G Protein-coupled Receptor Signa-ling Pathway）、与环状核苷酸第二信使偶联（Coupled to Cyclic Nucleotide Second Messenger）、化学突触传递（Chemical Synaptic Transmission）、脂多糖反应（Response to Lipopolysaccharide）、水解酶活性调节（Positive Regulation of Hydrolase Activity）、离子传输调节（Regulation of Ion Transport）、体液水平的调节（Regulation of Body Fluid Levels）、血压的调控（Regulation of Blood Pressure）、肽丝氨酸磷酸化（Peptidyl-serine Phosphorylation）、细胞对脂质的反应（Cellular Response to Lipid）、細胞对激素刺激的反应（Cellular Response to Hormone Stimulus）、机体活动的积极调节（Positive Regulation of Locomotion）、磷脂酰肌醇信号传导（Phosphatidylinositol-mediated Signaling）、趋化性调节（Chemotaxis）、激酶活性的正调控（Positive Regulation of Kinase Activity）、二价无机阳离子稳态（Divalent Inorganic Cation Homeostasis）等生物学功能发挥其治疗MS的作用。见图3。

2.5 核心靶点KEGG通路分析及核心靶点-生物功能-信号通路网络构建

KEGG通路富集分析结果显示中药复方知柏地黄丸可通过神经活性配体-受体相互作用（Neuroactive Ligand-receptor Interaction）、钙信号通路（Calcium Signaling Pathway）、VEGF信号通路（VEGF Signaling Pathway）、ErbB信号通路（ErbB Signaling Pathway）、FcεRI信号通路（Fc Epsilon RI Signaling Pathway）、细胞因子与细胞因子受体的相互作用（Cytokine-Cytokine Receptor Interaction）、T细胞受体信号通路（T Cell Receptor Signaling Pathway）、补体和凝血级联（Complement and Coagulation Cascades）等49条KEGG通路发挥治疗MS的作用。见图4。最后基于Cytoscape软件构建核心靶点-生物功能-信号通路网络。见图5。

3 讨论

MS是一组以肥胖、高血压、糖尿病或糖调节受损以及血脂异常等疾病的临床综合征，严重影响机体健康，甚至可导致各种心脑血管疾病的发生。目前国际上MS的诊断标准较多，常用的有3种：1999年世界卫生组织诊断标准[1]、2001年美国国家胆固醇教育纲要成人教育组第3次报告（NCEP-ATPⅢ）诊断标准[9]以及2005年国际糖尿病联盟诊断标准[10]。在2017年中华中医药学会发布的《中国2型糖尿病防治指南（2017年版）》中亦对我国MS的诊断标准做出了规范[11]。可见，MS越来越受到临床医生的重视。

中医古籍中并无MS的病名，依据其发病和临床表现，可参考“肥胖”“腹满”“胸痹”“眩晕”“痰饮”“消渴”“头痛”等范畴进行论治。中医药在治疗MS方面具有独特优势。知柏地黄丸出自《景岳全书》，为滋阴清热降火的代表方剂，是在六味地黄丸的基础上加知母、黄柏两味药而成。方中知母、黄柏清热滋阴润燥以治燥热之标，熟地黄用之可大滋肾阴，壮水之主;山萸肉色赤入心，味酸入肝，能够补肝益肾，从左以纳于肾。山药色白入肺，味甘入脾，能够祛寒热、补虚健中，从右以纳于肾。三药合用，既能五脏兼入，不致偏倚，又能将诸脏之气，尽行纳入肾脏，以为统摄脏阴之主。牡丹皮可清血分中热，具有凉血、解热、化瘀、和血之功效;泽泻味甘、寒，可化浊降脂、渗湿利水;茯苓可清气分之热，归心、肺、脾、肾经，具有利水渗湿、健脾宁心之功效;以上药物合用，共奏滋阴清热之功效。龚敏等[12]通过临床研究发现知柏地黄丸可有效降低葡萄糖耐量受损患者（IGT）的空腹血糖及餐后2 h血糖，减少腰围，降低血脂。

研究结果显示中药复方知柏地黄丸中含有化学成分74个，作用靶点906个，290个与MS共同靶点。通过对其进行PPI网络分析，得到78个核心靶点。研究结果显示中药复方知柏地黄丸可通过组成药物中的多种活性成分作用于STAT3、PIK3、PPAR、MAPK、EGFR、VEGFA等靶点，从而经过循环系统、G蛋白偶联受体信号通路、与环状核苷酸第二信使偶联、脂多糖调节、水解酶活性的调节、离子传输调节、体液水平的调节、调控血压、脂质代谢调节、机体活动调节等生物学功能以及VEGF信号通路、神经活性配体-受体相互作用、FcεRI信号通路、钙信号通路、ErbB信号通路等代谢通路发挥其治疗作用，同时也说明了其对MS潜在的调控机制。STAT3可以通过JAK2/STAT3信号通路，激活VEGF，从而诱导内皮细胞增殖[13-14]。PIK3R是PI3K的调节亚基，是PI3K/Akt信号传导通路的重要组成部分，Yang等[15]研究显示PIK3R3可以通过PPAR来调节肝细胞脂肪酸的β-氧化。PPAR是一种代谢性核受体，作为脂肪细胞分化和糖脂代谢过程中的重要调节因子，在脂肪细胞基因表达和胰岛素信号传导过程中均起到主要调节作用，其可通过参与机体的脂质代谢，进而调控脂肪酸吸收和脂肪的形成，其基因突变可引起IR[16]。MAPK是一类广泛存在于哺乳动物体内的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，可以通过调控蛋白p38 MAPK、JNK、ERK等参与细胞生长、炎症反应、氧化应激和细胞调亡等过程[17]。EGFR参与调控细胞代谢、增殖、迁移和分化，既往研究表明抑制EGFR信号通路的传导，可明显减少活性氧（ROS）的生成，从而抑制内质网应激反应[18-19]。VEGFA可维持血管正常状态及完整性、促进血管内皮细胞的增殖、增加血管的通透性、提高机体对损伤的修复[20-21]。李亚璞等[22]通过建立MS幼鼠模型及应用免疫组织化学观察其血管组织的病变程度发现，VEFG的含量与其血管的病变程度成正相关，说明VEFG可导致心血管疾病的发生，进而使MS病情加重。通过两方的比较分析，知柏地黄丸还可通过肽基丝氨酸磷酸化、细胞对激素刺激的反应、磷脂酰肌醇介导的信号传导、趋化性调节、激酶活性的正调控、二价无机阳离子稳态调节等生物学过程以及细胞因子与细胞因子受体的相互作用、补体和凝血级联等代谢通路从而进一步发挥其治疗MS的作用。毛连根等[23]通过应用知柏地黄丸治疗阴虚“上火”证大鼠，发现其可通过对大鼠血清凝溶胶蛋白（Gsn）、胸腺素β4（T-β4）、纤维蛋白原α链（Fga）、纤溶酶原（Plg）水平的调节，从而清除损伤组织，释放肌动蛋白和细菌脂多糖，抑制细胞凋亡，进一步说明知柏地黄丸具有调节炎症介质，改变炎症反应局部的血液流变学，促进炎症反应损伤愈合的作用。

综上所述，本研究基于网络药理学技术从成分、靶点、生物功能、代谢通路等多角度探索中药复方知柏地黄丸治疗MS的作用机制，为今后研究其药理机制提供参考，但后期仍需要实验对其进一步验证。

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（2019-10-25收稿 责任编辑：杨觉雄）