基于加权基因共表达网络分析槲皮素抗胃癌的基因模块和分子标志物研究

张林 欧祥琴 张涛 钟凯 吴学会 李睿思 李青璇 梁峰 张轩

摘要 目的：根據加权基因共表达网络（WGCNA）探索槲皮素抗胃癌的潜在生物靶标。方法：利用TCGA数据库下载胃癌相关转录组和临床数据，分析胃癌转录组表达的差异基因，利用网络药理学找到槲皮素的作用靶点，找出槲皮素与胃癌的hub基因。通过KEGG通路，GO基因富集分析寻找hub基因的靶点及通路，探索hub基因的在胃癌临床数据中的生存分析和性状表达的差异。结果：1）共发现槲皮素142个靶点，共139个蛋白质-蛋白质相互作用关系;2）KEGG通路富集分析发现槲皮素抗胃癌的作用通路可能与细胞衰老、MicroRNAs的表达、P53信号通路有关;3）生存分析发现纤溶酶原激活物抑制剂-1（SERPINE1）、微囊蛋白-1（Caveolin-1）、雄性激素受体（AR）、转录因子E2F2（E2F2）、前列腺素E2受体EP3亚型（PTGER3）在胃癌中的表达差异会影响患者的预后（P<0.05）;4）在胃癌的TNM分期中，AR与PTGER3的表达差异与胃癌的分期相关（P<0.05）;5）GEPIA数据库分析，AR与PTGER3在胃癌组织中的表达存在一定的相关性（P<0.05）。结论：槲皮素抗胃癌机制可能和细胞凋亡、MicroRNAs表达和P53信号通路有关，通过多靶点作用于SERPINE1、CAV1、AR、E2F2、PTGER3，发挥抑制癌细胞，改善患者预后的作用。

关键词 加权基因共表达网络;胃癌;hub基因;槲皮素

Study on the Mechanism of Quercetin Anti-gastric Cancer Gene Module and Molecular Marker Based on Weighted Gene Co-expression Network

ZHANG Lin1，OU Xiangqin2，ZHANG Tao3，ZHONG Kai3，WU Xuehui3，LI Ruisi3，LI Qingxuan3，LIANG Feng3，ZHANG Xuan4

（1 First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China; 2 The First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550001，China; 3 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301608，China; 4 School of Chinese Medicine，Hong Kong Baptist University，Hong Kong 99077，China）

Abstract Objective：To explore the potential biological target of quercetin against gastric cancer based on the weighted gene co-expression network（WGCNA）.Methods：TCGA database was used to download gastric cancer related transcriptome and clinical data to analyze the differential genes expressed in gastric cancer transcriptome.Meanwhile，network pharmacological means was used to find the drug action targets of quercetin and find the hub genes of quercetin in gastric cancer.The targets and pathways of hub genes were searched through KEGG pathway and GO gene enrichment analysis which were aimed to explore the survival analysis and trait expression differences of hub genes in clinical data of gastric cancer.Results：1）A total of 142 targets and 139 protein interactions were found for quercetin.2）Enrichment analysis of KEGG pathway found that the anti-gastric cancer pathways of quercetin may be related to cell senescence，the expression of MicroRNAs，and the P53 signaling pathway.3）Survival analysis found that the expression differences of plasminogen activator inhibitor-1（SERPINE1），microencapsulated protein-1（Caveolin-1），androgen receptor（AR），transcription factor E2F2（E2F2），and prostagtin E2 receptor EP3 subtype（PTGER3）in gastric cancer affected the prognosis of patients（P<0.05）.4）In TNM staging of gastric cancer，the difference in expression of AR and PTGER3 was correlated with the staging of gastric cancer（P<0.05）.5）GEPIA database analysis showed that there was a certain correlation between AR and PTGER3 expression in gastric cancer tissues（P<0.05）.Conclusion：The anti-gastric cancer mechanism of quercetin may be related to apoptosis，MicroRNAs expression and P53 signaling pathway.It acts on SERPINE1，CAV1，AR，E2F2，and PTGER3 through multiple targets to inhibit cancer cells and improve the prognosis of patients.

Keywords Weighted gene co-expression network; Gastric cancer; Hub genes; Quercetin

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.004

胃癌（Gastric Carcinoma，GC）是指源自胃黏膜上皮的恶性肿瘤，是全球发病率最高的5种肿瘤之一，在与癌症有关的死亡人数中排名第3位[1]。GC为全球医疗体系带来巨大的医疗和经济问题[2]。由于诊断和治疗方法的改进，早期GC患者生存率有所提高，但晚期GC的疗效不理想。而且由于GC的诊断往往被延迟，临床处理效率低，因此大多数GC病例诊断的时候已经表现为局部扩散或转移[3]。根据中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的《2018胃癌诊疗规范》[4]，GC的治疗原则是多学科综合治疗，使用手术、化疗、放疗和生物靶向治疗等手段，此规范同时指出中医药治疗GC有助于改善手术并发症，缓解放化疗的不良反应，肯定了中医药治疗GC的疗效。

槲皮素是多种中药的有效成分，研究发现，槲皮素对GC[5]、乳腺癌[6-7]、结肠癌[8]、子宫内膜癌[9]等具有抗肿瘤疗效。槲皮素[10]能抑制GC细胞的增殖和侵袭作用，在联合槲皮素化疗的研究中，可以通过抑制c-Jun的表达增强5-氟尿嘧啶对GC细胞凋亡[11]，联合伊马替尼可以诱导GC细胞通过Caspase-9和Caspase-3凋亡[12]。

加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA）基于变量相关性，挖掘生物体系内基因互作网络体系，利用转录组和临床数据寻找具有协同表达特性的基因模块，进一步探索基因网络与患者临床性状之间的关系。本研究的目的是根据癌症基因组数据库（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中GC的转录组与临床数据，利用WGCNA挖掘GC相关的基因网络，探索GC中特异表达的关键基因，进一步分析槲皮素抗GC的hub基因与靶点，为临床基础研究实验提供参考。

1 材料与方法

1.1 槲皮素靶点数据库的建立 通过检索中医药系统药理学（TCMSP）数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以化学成分“quercetin”作为筛选项，筛选目前已知槲皮素的全部作用靶点，再根据UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）获取对应靶点的简写，将靶点上传至String数据库（https：//string-db.org/cgi/input.pl），获取蛋白质的相互作用信息，并导入Cytoscape3.7.1，分析蛋白的相互作用关系。

1.2 TCGA数据的获取 本研究下载TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）数据库共407个GC相关的转录组数据，其中正常样本32个，肿瘤样本375个，下载455个与GC相关的临床数据，包括年龄，性别，GC TNM分期，生存时间等数据。

1.3 筛选GC差异基因（DEGs） 利用R4.0.0语言，先对数据进行注释和整理，使用DESeq2数据包进行差异表达基因筛选，使用Limma数据包，以LogFC>1，P<0.05作为筛选条件，筛选DEGs，再使用ggplot2数据包分别得到差异基因的火山图和聚类热图。

1.4 特异基因网络模块的分析 利用R4.0.0语言的WGCNA数据包，构建GC加权共表达网络[13]。先构建接近真实生物网络状态的无尺度网络，使用函数Pick Soft Threshold选择合适的阈值参数β。然后根据确定的阈值，以基因间皮尔逊相关系数构建邻接矩阵，转换拓扑矩阵，接着进行层次聚类，再用分支切割法（Branch Cutting Method）来识别构建模块。本研究中以最小尺寸50为分割的基因树状图，建立平均连锁层次聚类，将相似基因划分为一个模块，根据正常组织和GC组织中的基因表达差异，筛选最优模块。

1.5 蛋白质互作网络（PPI）的构建 hub基因是槲皮素靶点与差异基因的靶点取交集，上传至String数据库（https：//string-db.org/cgi/input.pl），获取蛋白的互作用信息，并导入Cytoscape3.7.1，找出蛋白之间的互作用关系。

1.6 富集分析与生存分析 根据GC WGCNA的最优模块和差异基因，使用R4.0.0语言做KEGG和GO富集分析，并将hub基因根据临床数据进行比较，挖掘槲皮素抗GC的关键基因。

1.7 GEPIA验证 将和临床资料差异分析后具有统计学意义的关键基因带入GEPIA数据库（http：//gepia2.cancer-pku.cn/△index），查询关键基因的表达与GC的关系，以及基因之间在GC组织的表达是否具有相关性，探索槲皮素抗GC机制。

2 结果

2.1 槲皮素靶点 通过中药网络药理学平台可知，槲皮素共有142个靶点，导入String数据库，共有139个互作用蛋白，根据度值筛选出前15互作用蛋白。见表1。

2.2 差异基因 根据TCGA数据库获得的407个临床样本，共获取2 785个差异表达基因，包括1 570个下调基因，1 125个上调基因，火山图与差异性排名前40基因的聚类热图。见图1。

2.3 WGCNA模块分析 根据R4.0.0语言，筛选出4为软阈值，根据软阈值做分层聚类树，共得到

14个模块，以此所获取的分层聚类树与相关模块的表达差异如图2所示，可知在藍色模块与GC的相关性最高（R=0.55，P=5e-33）见图2（B），正常组织与肿瘤组织的表达关联最大，选择此模块中的基因与2.2中的差异基因取交集，共得到463个基因。

2.4 GO与KEGG的富集分析 将2.3所获取的463个基因通过R4.0.0进行基因ID转换，通过clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot数据包，对交集基因做GO与KEGG富集分析。见图3。GO富集分析显示GC与DNA和细胞的增殖分化有关，KEGG富集分析与细胞衰老，MicroRNAs的表达、P53信号通路有关，相关的基因富集信息见表2。

2.5 槲皮素hub基因的生存分析 将槲皮素的靶点与差异基因做交集，获得42个槲皮素抗GC的hub基因，导入String数据库，使用Cytoscape3.7.1绘制蛋白质-蛋白质相互作用网络，如图4，根据TCGA下载的GC相关的临床数据，先删除正常样本，再观察hub基因在临床生存与肿瘤分期的表达差异是否有统计学意义。槲皮素延缓GC患者的生存期，可能和5个基因有关，分别是纤溶酶原激活物抑制剂-1（SERPINE1）、微囊蛋白-1（CAV1）、雄激素受体（AR）、转录因子E2F2、前列腺素E2受体EP3亚型（PTGER3），且P<0.05。见图5。

将所挖掘出的5个hub基因对肿瘤分期差异进行分析，分析的临床数据所使用的是TNM分期[4]。发现在AR的表达中，Ⅰ期对Ⅱ期，Ⅲ期，Ⅴ期表达差异有统计学意义（P<0.05）;PTGER3的表达中，Ⅰ期对Ⅱ期，Ⅲ期，Ⅴ期差异有统计学意义（P<0.05），其他基因在GC各期的表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图6。

2.6 GEPIA验证 将2.5所得到的SERPINE1、CAV1、AR、E2F2、PTGER3带入GEPIA数据库进行验证，组织种类选择GC（STAD），通过无病生存期（Disease Free Survival，DFS）分析，结果AR、PTGER3和SERPINE1在DFS验证中，高表达与低表达对DFS差异有统计学意义（P<0.05）。见图7。由2.5中可知AR与PTGER3的表达对GC的分期差异有统计学意义，选择这2个基因做关联，发现（R=0.54，P<0.05），说明AR与PTGER3的基因表达在GC组织中呈现正相关，差异有统计学意义。

3 讨论

根据全国肿瘤登记中心2015年发布的报告，我国GC发病率高达67.9万，仅次于肺癌（73.3万）[14]。在GC的病因中，幽门螺旋杆菌是GC发生的Ⅰ类因子，基因多态性也是GC发生的原因，GC的发生发展与CDH1，RUNX，IL-6，IL-10，IL-1β，TNF等有关[15]。本研究槲皮素的互作蛋白中，IL-6，TNF，RUNX，IL-1β均是槲皮素的作用靶点，槲皮素的抗GC机制也许和这些靶点有关。

本研究对槲皮素抗GC机制进行分析，在GO，KEGG富集分析中，发现槲皮素的抗GC机制可能与细胞衰老、MicroRNAs的表达、P53信号通路有关。在MicroRNAs的相关研究中，槲皮素通过促进miRNA-206/connexin 43途径刺激骨髓基质细胞的成骨分化，调控细胞的生长周期[16]，在氧化应激的情况下，槲皮素和儿茶素的共同作用可以通过抑制let-7a-5p和miR-25-3p调节细胞增殖[17]。细胞凋亡是细胞程序性衰老和死亡的组成，对调控肿瘤细胞的增殖具有重要作用，在细胞凋亡的相关研究中，槲皮素能通过调节活性氧诱导的内皮细胞凋亡来降低动脉粥样硬化[18]，诱导结肠癌细胞的凋亡[19]。槲皮素有良好的抗肿瘤机制，含有槲皮素的消癌解毒方具有抗结肠癌的疗效[20]，其作用机制可能与P53信号通路有关[21]。槲皮素联合喜树碱能促前列腺癌PC-3细胞的凋亡[22]。在P53信号通路中，槲皮素能通过上调P53来增强曲古抑菌素A的抗肿瘤活性[23]，在HPV陽性的宫颈癌中，通过诱导P53活化调节癌细胞的凋亡[24]，通过既往文献分析，槲皮素的抗GC机制可能与细胞凋亡、MicroRNAs的表达、P53信号通路有关。

在槲皮素与GC相关基因的生存分析中，SERPINE1、CAV1、AR、E2F2、PTGER3在人体表达的高低对患者的预后有影响（P<0.05）。在肥胖患者中，槲皮素的保护作用不仅是由于清除自由基的活性，而且还直接影响线粒体过程，并与SERPINE1有关[25]，在一项GC的数据挖掘中，发现SERPINE1的表达与年龄，T分期相关，能影响GC患者的预后[26]，SERPINE1表达情况是影响GC预后的独立危险因素。槲皮素的抗GC机制可能与SERPINE1有关。CAV1的表达与GC的分期和严重程度呈负相关[27]，槲皮素可抑制GC SGC-7901细胞CAV1的表达，GC细胞的凋亡可能与CAV1表达有关[28]。槲皮素可以通过雄激素受体和PI3K/Akt信号通路逆转前列腺癌中的多西他赛耐药性[29-30]。NRAS和E2F2能增强GC细胞对基于顺铂化疗的敏感性，E2F2的表达水平与抑癌基因mi R-31的表达水平呈显著负相关[31]，抑癌基因miR-365可以通过E2F2抑制GC细胞增殖[32]。本研究无病生存率的分析中发现，AR、PTGER3和SERPINE1的高表达会影响患者的无病生存率。

综上所述，本研究根据WGCNA网络，对槲皮素治疗GC的基因模块进行筛选，发现槲皮素抗GC的机制可能与细胞凋亡、MicorRNAs的表达和P53信号通路相关，对hub基因进行临床数据的生存分析，发现SERPINE1、CAV1、AR、E2F2、PTGER3可能是槲皮素抗GC，改善患者预后的靶点，AR与PTGER3可能是槲皮素抗GC，影响GC分期的靶点，且AR与PTGER3在GC中的表达存在一定的相关性。以上研究结果具有一定意义，有助于以后槲皮素抗GC的临床研究和靶点治疗。

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（2020-09-11收稿 责任编辑：王明）