载脂蛋白E基因敲除小鼠颈总动脉粥样硬化的超声生物显微镜成像与病理检测的对比分析①

盖敏涛，刘 芬，陈小翠，陈邦党

（新疆医科大学1基础医学院，2临床医学研究院，乌鲁木齐 830011）

动脉血管壁上纤维脂质斑块的形成引起动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS），并导致心梗等心血管疾病发生，是导致疾病死亡的主要原因之一[1]。载脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein e gene knock out,ApoE-/-）小鼠可以在动脉血管自发形成AS斑块，是良好的AS模型，其广泛应用在AS疾病研究中[2]。由于小鼠的颈动脉血管非常细小，既往的普通超声系统很难识别和检测小鼠颈动脉的AS特点。因此基础研究常通过处死小鼠以获取组织进行病理检测来观察小鼠AS进展特点，但AS小鼠模型通常需要4个月以上的建模时间。近年来开发的超声生物显微镜（ul⁃trasound biomicroscopy,UBM）开始应用在小型动物中，能实时、准确、无创的检测小型啮齿类动物体内血管斑块，其能够通过检测主动脉根部以及主动脉升部血管以检测AS[3-4]。临床上常通过检测左颈总动脉的内-中膜厚度(Intima-media thickness,IMT)来反应颈动脉AS以及预测潜在心血管事件的发生[5]。通过检测颈总动脉相关指标可以预测斑块破裂[6]。中国中老年人群颈总动脉AS有36.2%伴随有IMT、斑块以及狭窄程度增加[7]。本研究通过UBM方法检查ApoE-/-小鼠左颈总动脉血管与AS特点相关的指标，并与病理检测结果比较，从而探讨UBM方法能否作为检查ApoE-/-小鼠左颈总动脉血管AS进展的有效检测方法，并寻找评价小鼠AS进展特点的可靠指标。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要仪器

1.1.1 实验动物 本实验使用8周龄ApoE-/-雄性小鼠15只，采用自身前后对照设计，所有小鼠从北京维通利华公司购置（小鼠生产和使用合格证号：SCXK(京)2012-0001）。动物在新疆医科大学动物实验中心饲养。动物使用遵守新疆医科大学动物中心实验对动物的处理方法，符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.1.2 主要仪器 本实验使用Vevo3100小动物超声成像系统(富士VisualSonics,多伦多,加拿大)进行检测，配备40MHZ的电子线阵超声探头（型号MX550D）。麻醉系统使用Matrx VMR小动物麻醉机（MIDMARK，美国）。冰冻切片机使用CM1950冰冻切片机（莱卡，德国）。图像采集使用DM3000图像采集系统（莱卡，德国）。

1.2 ApoE-/-小鼠AS模型的复制小鼠AS模型建立按照前期方法建立[8]，即通过适应性喂养1 w后，用含21%脂肪和0.25%胆固醇的高脂饲料喂养至实验结束。

1.3 检查方法

1.3.1 UBM超声检查方法 使用异氟烷麻醉机诱导（浓度2.50%）和维持（浓度1.50%）小鼠麻醉，小鼠固定在监测台，全程体温维持在36.5℃左右，心率维持在300～400次/min。颈部区域进行脱毛处理，充分暴露皮肤，调整操作台使小鼠左侧向上5°，检测最大深度为1.5 cm，检测聚焦在0.7 cm深度。先找到左颈总动脉纵轴血管，检测位置离左颈总内、外动脉分叉处1～3 mm处，将探头旋转90°，在短轴检测其IMT以及狭窄程度，IMT的测量方法参照人血管IMT的测量方法[9]，SI图像获取通过留取动态图像。将检测的IMT、SI的B-mode动态图片导入vevolab软件系统中，使用血管分析设置进行测量分析，在血管舒张期末截取静态图像。通过将vevolab软件中获取的图像导入ImageJ 1.46r软件，获取血管内膜面积及血管腔面积进行分析。

1.3.2 组织取材、处理与包埋 小鼠处死后，打开胸腔，充分暴露主动脉血管，分离完整主动脉。将剥离的主动脉置入4%多聚甲醛固定12 h后，使用PBS清洗，将主动脉分叉处的左颈总动脉血管从分叉根部至远端1 cm进行裁剪后，使用OCT包埋剂包埋于包埋座上，注意组织从上到下垂直包埋并置于干冰上。包埋剂充分凝固后，将包埋块在冰冻切片机内-20℃条件下，进行切片，切片厚度6 um，切下组织粘附在氨基酸防脱载玻片上，每个样本留取5张切片，-20℃保存待用。

1.3.3 HE染色方法 切好的片子复温后置入蒸馏水中2 min，随后苏木素染液染色2～5 min,水洗，0.5%盐酸酒精分色片刻，PBS中返蓝，0.5%伊红染液染色1～2 min，清水洗2 min，随后使用酒精逐级脱水，滴加中性树胶封片。

1.3.4 油红O染色 染色方法参考文献[8]，斑块面积%=斑块面积×100%/管壁总面积[10]，左颈总动脉血管油红O染色，具体步骤同上，最终使用水性封片剂封片。

1.3.5 染色切片IMT及SI的测量 使用ImageJ 1.46r软件测量HE染色获取的左颈总动脉血管横断面图像，分别分析IMT及SI；SI测量通过分别圈取血管内膜、血管腔，测量其面积，然后计算SI，计算公式为[（血管内膜面积－腔面积）/血管内膜面积][11]。

1.3.6 小鼠血脂检测将收集的全血进行血浆分离后，使用AU5800全自动生化分析仪（美国贝克曼公司）检测血清总胆固醇。

1.4 统计学分析使用SPSS 16.0软件进行，所有资料均为计量资料，通过均数±标准差（±s）表示。计量资料比较采用重复测量数据单因素方差分析和SNK方法进行检验。两样本相关性分析通过Pear son相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠AS模型的特点在第24周处死小鼠，看到小鼠主动脉弓部和左颈总动脉有白色斑块样组织附着（图1 A）。主动脉油红O大体染色可见小鼠主动脉血管内斑块形成，经检测斑块面积为（21.80±2.33）%，并且在颈总动脉可以看到红色的斑块（图1 B、C）。总胆固醇含量为(14.85±1.70)mmol/L，达到一般AS小鼠血脂指标范围。以上油红O染色及血脂结果表明AS模型复制成功。

图1 ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型的主动脉血管解剖图像和油红O染色结果

2.2 UBM检查AS小鼠不同时间点左颈总动脉血管的变化UBM检查结果显示，左颈总动脉的IMT和SI指标随时间呈递增趋势。在第16周、第20周和第24周的IMT检测结果分别为(0.11±0.01)mm、(0.14±0.01)mm、(0.15±0.01)mm，并且第20周和第24周的IMT结果较第16周均有显著增加(P=0.010和P=0.002)（图2 A）。在第16周、第20周和第24周的SI结果分别为(61±11)%、(73±8)%、(77±4)%，第20周、第24周与第16周比较均有显著增加(P=0.006和P=0.005)。见图2B。

2.3 UBM检测结果与病理学检测结果UBM检查获得的左颈总动脉图像表明在第16、第20和第24周，随着AS模型时间的延长，左颈总动脉血管的管壁逐渐增厚，血管管腔逐渐狭窄（图3）。在第24周的油红O染色及HE染色检测结果也显示左颈总动脉的血管壁增厚，管壁有斑块，管腔有狭窄（图4）。

图2 UBM检查左颈总动脉血管IMT和SI的变化趋势

图3 UBM检查不同时间点的左颈总动脉横轴图像

图4 正常小鼠和AS小鼠模型第24周左颈总动脉的油红O染色及HE染色结果

2.4 UBM检查与病理检查结果的比较和相关性分析在第24周的UMB检查的IMT结果与病理学HE染色检测的IMT结果比较差异无统计学意义[(0.15±0.01)mmvs(0.18±0.04)mm,P＞0.05]。UMB检查的SI结果与病理学HE染色检测的SI结果差异有统计学意 义[(53±12)%vs(77±4)%,P=0.017]。见 图5 A、B。两种检测结果呈正相关（r=0.80，P=0.016）。见图5 C。

图5 第24周UBM检查结果与病理学检测结果的比较与相关性分析

3 讨论

已有研究显示，使用UBM检测到的ApoE-/-动脉粥样硬化小鼠的升主动脉的IMT为0.12～0.25 mm，血浆TC值在10～20 mmol/L[12]，AS小鼠模型颈总动脉的狭窄程度为（0.72±0.15）%[13]，主动脉大体油红O染色的斑块面积为(29.8±3.2)%[8]，均与本研究检测结果接近。提示本研究中的AS模型成功，且检测的主要结果与其它研究相接近，但由于检测部位和时间上的不同，存在小的差异。本研究结果表明，UBM检查小鼠左颈总动脉的IMT指标是反映小鼠左颈总动脉AS的进展趋势的良好指标。说明UBM检查ApoE-/-小鼠左颈总动脉可以作为一种无创性的检查方法评价AS进展。

UBM目前被用于在体微小结构检测，包括眼睛病变，小鼠心脏血流，以及血管形态和斑块等检测中[14-16]。Zhang等[3]使用UBM检测LDL-R基因敲除小鼠主动脉根部的IMT，其UBM的检测结果与病理结果一致。Liu等[12]研究显示血浆中miR-217水平与UBM检查的升主动脉的IMT水平相关。本研究通过UBM检测ApoE-/-小鼠的左颈总动脉IMT，发现其与病理学检测结果也一致且呈正相关，说明UBM在检测主动脉血管的IMT是一个可靠的检测方法，能够反映AS的进展程度。

颈动脉狭窄增加了心血管疾病和脑中风的风险。Jung等[17]研究显示，颈动脉狭窄与人体外周血管疾病相关，使用超声检测人体颈动脉狭窄程度是一种筛选外周血管疾病伴随多级病变和心血管疾病的有效的手段。Haberka等[18]研究显示，颈总动脉狭窄程度和IMT等指标可以预测高危心血管疾病病人血运重建风险。本研究通过模拟人体检测方法，检测ApoE-/-小鼠左颈总动脉的狭窄情况，表明其管腔随着模型建立时间的延长而逐渐缩窄，能够显示AS形成的趋势，但其与病理检测结果存在不一致。可能是病理检测的固定血管状态和UBM超声检测的血管在体收缩运动的血管状态存在差异，也可能是本研究中UBM超声检测SI的方法还不够完善。以上研究说明超声检测AS的SI指标可以表现其AS进展趋势，但与病理学检查的官腔狭窄情况存在差异。

本研究还存在一些不足之处，首先，在使用UBM进行不同时间点的检查的同时，病理学检测仅在第24周检测，如果在不同时间点也进行病理学的检测，研究结果将更加完善；其次，本研究的血脂结果仅有总胆固醇的数据，缺少其它血脂水平数据。

综上所述，UBM检查ApoE-/-小鼠左颈总动脉IMT指标与病理学检测结果一致，能够较好的表示AS模型进展。UBM检查ApoE-/-小鼠左颈总动脉SI指标能较好地表示AS进展趋势。UBM成像作为一种无创检测方法可以准确评价ApoE-/-小鼠颈总动脉血管粥样硬化的病变进展程度。