结直肠锯齿状腺瘤患者BRAF V600E表达的特征分析及诊断价值①

郭云泉，王翠翠，岳 娜，胡佳捷

（新疆医科大学附属肿瘤医院病理科，乌鲁木齐 830011）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）发病率和致死率是全球最高的三大恶性肿瘤之一，CRC大多早期症状不明显导致患者忽视身体表现，被诊断时已到中晚期。CRC起源于癌前病变，通常称为直肠息肉。锯齿状腺瘤（serrated adenomas，SA）含有锯齿状隐窝结构的特征，是介于增生性息肉和传统腺瘤之间的腺体增生，早期内镜下多表现为无蒂齿状腺瘤及混合性息肉，并且存在不稳定性异质损害，进一步可演变成CRC。SA病理特征为隐窝上皮有“锯齿状”外观，有报道显示该类特征演变发生腺癌的可能性在1%左右，是结直肠重要的致癌途径之一[1]，在最新的WHO指南中，具有恶变可能性的SA包括无蒂SA/息肉（SSA/P）和传统SA（TSA）。BRAF是人类最重要的原癌基因之一，BRAF绝大部分突变形式为BRAF V600E突变，在肿瘤的发生发展中充当重要信号传导角色，BRAF的蛋白是有丝分裂原活化的蛋白激酶细/胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）途径蛋白，是一种高效的磷酸化剂，在凋亡和增殖过程中起着重要作用，而通路入口处的MAPK可通过核内转录因子链接细胞表面受体和蛋白，激活多种效应蛋白，从而使细胞对外来信号产生生物学应答。有研究显示BRAF V600E蛋白可在多种癌前病变中早期表达[3]。本研究对新疆医科大学附属肿瘤医院就诊的80例SA患者进行研究，探讨BRAF V600E蛋白表达在SA患者中的诊断意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择本院消化肿瘤科2017年5月－2020年4月确诊的80例SA患者，男性38例，女性42例，≤50岁26例，＞50岁54例，平均年龄（57.32±4.61）岁，其中高度异型增生20例、中度异型增生36例、低度异型增生24例。另收集同期在院就诊经内镜或手术切除并无病例确诊的结直肠增生性息肉标本40例、CRC组织标本40例作为对照观察。

1.2 纳入和排除标准纳入标准：（1）经检查确诊SSA/P、TSA者，具有典型的锯齿状腺管样结构的。（2）能完整获取结肠镜检查资料，包含肿瘤大小、形态、数量等。排除标准：（1）伴有消化道恶性肿瘤及术后患者。（2）炎性肠病稳定期或恢复期。（3）伴有严重心血管疾病、沟通障碍者。

1.3 方法采用兔抗人BRAF V600E抗体（中杉金桥公司，克隆号RM8，可检测BRAF基因V600E的突变）；PV9000试剂盒使用北京中杉金桥生物技术有限公司产品，一抗稀释度为1∶600，以微波枸橼酸盐进行抗原修复3，3一二氨基联苯氨(DAB)显色，操作如下：取5µmSA厚切片60℃烤箱烤片5 h，二甲苯脱蜡3次各10 min后梯度酒精各10 mim，通过滴加3%过氧化氢液室放入温室避光孵育15 min，阻断内源性过氧化物酶活性，在使用蒸馏水冲洗PBS洗3次。将BRAF浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液中进行抗原修复，入微波炉中温度100℃、火力20加热10 min，自然冷却后PBS冲洗2 min×3次，滤纸吸干PBS液。滴加BRAF(1∶600)入湿盒内冰箱过夜，温度设置4℃，次日PBS冲洗2 min×3次，再滴入通用型抗体-PV9000，37℃室温孵育l5 min，PBS冲洗2 min×3次。滴入辣根酶标记链酶卵白素工作液，室温下孵育15 min。二氨基联苯氨底物显色，显色时间10～20 min，显微镜下观察显色，发现背景出现后立即控制放入水中止显色，给予苏木素20 s染色，自来水冲洗后用1%盐酸酒精分化2 s，自来水复洗氨水反蓝1 s再次冲洗。最后通过75%、90%、100%酒精各5 min，二甲苯3次各10 min脱水透明，中性树胶封片。用PBS液代替一抗作为阴性进行对照。

1.4 判断标准BRAF V600E蛋白染色出现棕黄色颗粒为阳性，根据文献[4]方法，选患者典型腺上皮区域进行400倍镜下观察阳性细胞数，阳性细胞数分为0、1、2、3个分数，分别代表阳性性细胞数0、＜25%、≤25%～50%、≤51%～75%、＞75%。不同分数染色强度分别代表无染色、淡棕黄色、棕黄色、深褐色。1～4分为弱阳性（+），5～8分为中等阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。

1.5 统计学方法通过SPSS17.0软件对所有数据进行分析，所得计数资料按率（%）表达，并使用x2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中BRAF V600E蛋白检出情况

BRAF V600E蛋白在结直肠癌（colorectal can⁃cer，CRC）、锯齿状腺瘤和增生性息肉中均有不同比例的表达，三者间BRAF V600E阳性率差异均有统计学意义（P＜0.05），其中HP明显低于SA，而CRC明显高于SA，见表1。不同组织的病理表现见图1。

2.2 BRAF V600E表达水平与SA患者临床参数的关系BRAF V600E表达水平与SA患者的年龄、性别无明显关系（P＞0.05），但而随着SA异型增生程度的加重，BRAF V600E蛋白基因表达水平也随之增加，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 BRAF V600E在CRC患者结直肠黏膜中的检出率对比/例（%）

图1 不同组织的病理表现

表2 BRAF V600E表达与SA患者临床参数的关系/例（%）

2.3 BRAF V600E表达水平与CRC患者淋巴结转移的关系BRAF V600E表达水平在淋巴结转移的CRC患者中表达水平明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 BRAF V600E表达水平与CRC患者淋巴结转移的关系/例（%）

3 讨论

CRC的发生发展是一个涉及多个基因、多步骤的复杂过程，包括癌基因的激活或抑制失活。其中，BRAF是参与癌基因的激活、凋亡以及基因功能紊乱调节等过程的重要基因，是引发CRC的演进的主要信号分子之一。BRAF是一种蛋白激酶，能够参与MAP激酶级联反应，与生长因子结合促进细胞的生长、繁殖、迁移及分化，临床上癌症患者中发现BRAF致癌变异大约有8%，而CRC患者诊断中，约15%存在BRAF基因突变[5-6]，突变基因转录并翻译为BRAF V600E蛋白。BRAF V600E蛋白受负电荷基因模仿的活化区磷酸化改变不受依赖，导致前有丝分裂原有效分裂能力的增强，促使细胞异常繁殖和分化新成肿瘤。有关研究显示[7-8]，BRAF V600E蛋白转染到黑色素细胞中，会导致黑色素细胞形态的恶性转化，将该细胞株接种到裸鼠体内能发现其呈侵袭性生长，并导致肿瘤形成。

有学者通过分析结直肠息肉患者中的55个异型隐窝灶（ACF），结果显示在33例非锯齿状病变中仅有1例检出BRAF变异，而16例锯齿状病变有10例检出BRAF V600E变异，差异有统计学意义，因此认为发现锯齿状形态可能与BRAF变异有较强相关性[9]；此外，在增生性息肉（Hp），BRAF变异的发生率既往报道中在30%～40%不等[10]。本研究显示，在SA、HP以及CRC中均可检查出BRAF V600E突变蛋白，且SA阳性率介于HP与CRC两者之间。且进一步分析了SA的异型增生程度与BRAF V600E蛋白表达水平的关系，结果显示，高度异型增生的SA组织中BRAF V600E蛋白阳性率明显提高，提示当SA组织中BRAF V600E蛋白的表达量与结直肠息肉患者经由锯齿状病变-腺癌途径的癌变风险存在较强的相关性，因此可以早期明确诊断，判断预后，并进一步指导治疗，提高临床诊疗效果。

BRAF突变引起SA恶性演化的机制可能与其导致ERK、NF-KB活性和NIH3T2D转化能力的提高有关。BRAF V600E蛋白通过对上述信号分子的影响改变整合素的表达、促进细胞增殖和侵袭、降低E-钙黏素表达并增加基质金属蛋白酶（MMP）的分泌[11-12]，进而促进恶变组织的浸润转移，因此可在CRC发生、发展及分化转阴等过程中将起到重要作用。本研究显示，在出现淋巴结转移的CRC患者中，BRAF V600E蛋白的表达水平明显更高，提示BRAF V600E基因突变不仅与SA的癌变几率有关，还与患者恶性转化后出现远处转移等不良预后的风险密切相关。

综上所述，BRAF V600E蛋白在SA患者中具有早期诊断及预后判断的作用，在结直肠SA中的表达量与异型程度呈正相关，也与CRC出现淋巴结转移密切相关。对SA进展趋势及癌变的不良预后具有一定预测价值，有望成为早期诊断及预后判断的重要分子。通过BRAF V600E蛋白水平检查能够反映SA患者病情的发展变化，值得临床推广运用。