柴胡加龙骨牡蛎汤对七氟醚致老年大鼠认知损害的保护作用研究

莫蓓，何佩娟，杨垂勋

1.江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330006；2.江西省胸科医院，江西 南昌 330006

七氟醚麻醉的好处是患者术后苏醒比较快、对呼吸道的作用很温和［1］，被广泛运用于老年麻醉。然而近年的研究显示［2］，老年病人在接受七氟醚麻醉后更容易发生认知方面的问题，经方柴胡加龙骨牡蛎汤常用于神经疾病的诊治中［3-4］。但柴胡加龙骨牡蛎汤是否可用于防治七氟醚麻醉导致的术后认知损害，尚无文献报道。本研究通过观察经方柴胡加龙骨牡蛎汤对七氟醚所致神经认知障碍的改善作用探讨其可能机制，以期为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药品

1.1.1 实验动物 本实验所用动物为96 只18 月龄SPF 级老年SD 大鼠，雌雄各半（长沙天勤生物技术公司，实验动物合格证号：430047000012185），放置在屏障级标准动物饲养间内饲养。

1.1.2 主要药品 柴胡加龙骨牡蛎汤（汉方医药公司）；七氟醚（济南仁源公司）；细胞裂解液（武汉友联特公司）；兔抗鼠NF-κB p65 抗体（南京森贝伽公司）；羊抗兔二抗（杭州格朗瑞公司）；ELISA试剂盒（深圳子科公司）

1.2 方法

1.2.1 实验分组、建模及干预 将所有大鼠按随机数字表法分成单纯七氟醚组（S 组）、柴胡加龙骨牡蛎汤预处理组（B 组）、柴胡加龙骨牡蛎汤预处理对照组（BC 组）以及空白对照组（C 组），每组24 只。S 组和B 组建立七氟醚致认知损害模型，B 组以及BC 组给予柴胡加龙骨牡蛎汤干预，C 组对照。步骤：S 组接受麻醉前1 周，每天采用1 mL/100 g 的生理盐水进行灌胃一次，持续14 d，此后连续3 d 吸入2.6%七氟醚+2 L/min 氧气2 h；B 组麻醉前14 d 每日持续给予1 mL/100 g 的柴胡加龙骨牡蛎汤悬浊液灌胃（按体表面积折算动物给药剂量），此后连续3 d 吸入2.6%七氟醚+2 L/min 氧气2 h。BC 组接受与B 组相同的预处理，此后连续3 d 吸入空气2 h。C 组术前每天采用1 mL/100 g 的生理盐水进行灌胃一次，持续14 d，此后3 d 每日吸入空气2 h。

1.2.2 Morris 水迷宫观察大鼠空间学习记忆能力 将大鼠面向圆形桶壁依次从4 个象限入水，放一隐藏平台，记录逃避潜伏期。结束后2 h，撤去平台，大鼠游泳120 s，记录跨台次数。

1.2.3 TUNEL 法观察海马CA1 区神经元数量 每组选8 只大鼠，取大鼠脑组织，按照TUNEL 试剂盒说明书操作。显微镜观察神经元数量。

1.2.4 ELISA法检测炎症因子表达 每组选8只大鼠，取大鼠脑组织，按照ELISA 试剂盒说明书操作，检测炎症因子表达。

1.2.5 Western blotting 观察NF-κB p65 表达 用细胞裂解液提取海马组织蛋白，BCA 法蛋白定量；取50 μg 蛋白在SDS-PAGE 上电泳，NF-κB p65 蛋白抗体，4 ℃孵育过夜；加入辣根过氧化物酶标记的二抗，常温孵育l h 曝光成像。β-actin 作内参。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠空间学习记忆能力

1～4 d 时，S 组大鼠的逃避潜伏期比C 组长（P＜0.05），B 组大鼠逃避潜伏期比S 组短（P＜0.05）。S 组大鼠跨台次数比C 组多（P＜0.05），B 组大鼠跨台次数比S 组少（P＜0.05）。BC 组与C 组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 大鼠逃避潜伏期以及跨台次数（）

表1 大鼠逃避潜伏期以及跨台次数（）

注：与C组比：aP＜0.05；与S组比：bP＜0.05。

2.2 各组大鼠海马CA1 区神经元计数

S 组神经元数量比C 组少（P＜0.05）。B 组海马神经元数量比S 组多（P＜0.05）。BC 组与C 组差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 大鼠海马CA1区神经元数量（）

表2 大鼠海马CA1区神经元数量（）

注：与C组比：aP＜0.05；与S组比：bP＜0.05。

2.3 各组大鼠海马组织中炎症相关因子

表3 结果，S 组炎症因子水平比C 组高（P＜0.05）。B 组炎症因子水平比S 组低（P＜0.05）。BC 组与C组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α表达（）

表3 大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α表达（）

注：与C组比：aP＜0.05；与S组比：bP＜0.05。

2.4 各组大鼠NF-κB p65 的表达

表4、图1 结果，S 组NF-κB p65 表达比C 组高（P＜0.05）。B 组大鼠NF-κB p65 表达比S 组高（P＜0.05）。BC组与C组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 大鼠NF-κB p65表达（）

表4 大鼠NF-κB p65表达（）

注：与C组比：aP＜0.05；与S组比：bP＜0.05。

图1 大鼠NF-κB p65表达（PAGE电泳图）

3 讨论

七氟醚麻醉可能会引发老年病人出现认知功能障碍［5］。海马是存在于大脑组织一个部分，目前大量关于认知的研究亦集中于海马［6-7］。本研究结果，接受七氟醚麻醉的大鼠逃避潜伏期变长，跨台次数变少，这提示在七氟醚麻醉后大鼠的认知的确有障碍，同时，大鼠的海马区神经元数量也在减少，说明七氟醚对大鼠的海马结构亦产生了不利的影响。

老年人在受到应激、创伤、麻醉等过程后会诱发机体产生炎症反应，导致NF-κB 通路的活化，进一步加剧中枢和外周炎症因子表达，以此来损伤神经元细胞，从而造成认知功能障碍［8-9］。在本研究中，NF-κB 通路被激活，NF-κB p65 表达增多，七氟醚麻醉的老年大鼠脑中IL-1β、IL-6 和TNF-α 显著高于正常大鼠，提示七氟醚麻醉加剧神经系统产生炎症反应。

柴胡加龙骨牡蛎汤是一种传统中药方剂，能够对精神疾病有很好的缓解作用［8］。动物实验也显示［10］，柴胡加龙骨牡蛎汤也能改善阿尔茨海默病模型大鼠的精神状态。本实验结果与之相似，在经过此方干预后，大鼠认知明显改善，同时，NF-κB p65 表达下调，炎症因子的水平随之降低，神经元数上调，提示柴胡加龙骨牡蛎汤会阻碍NF-κB p65的表达，抑制炎症因子表达，进而减轻对神经元细胞的伤害而发挥作用。另外对正常大鼠使用此方并不会影响大鼠机体各项指标，提示其安全性也比较可靠。