HPLC 法测定复方鲜竹沥液（无糖型）中甜菊苷的含量

吴春花，李诒光，张民，胡子庆，杨凌宇

江中药业股份有限公司，江西 南昌 330000

复方鲜竹沥液为口服液，处方由鲜竹沥、鱼腥草、生半夏、生姜、枇杷叶、桔梗、薄荷素油组成，具有清热化痰，止咳之功，临床用于治疗支气管炎，咳嗽性哮喘，慢性阻塞性肺疾病［1-6］等。该品种的制法项规定添加蔗糖或甜菊素等甜味剂。无糖型添加甜菊素作为甜味剂。甜菊素又称甜菊糖苷或甜菊糖，是从甜叶菊的叶子中提取的一种甜味剂，为四环二萜类化合物［7］，凭借其热量低、易溶于水或酒精，也具耐热性，可谓无热量之代糖产品，是糖尿病患者的饮食或瘦身食品常用甜味料，可以广泛用于各类食品、医药等。《中国药典》2020 年版四部规定“本品是以甜菊素为主的混合苷。按干燥品计算，含甜菊糖苷以甜菊苷（C38H60O18）不得少于95.0%”，含量的测定采用容量法［8］。甜菊糖苷在食品行业中应用非常广泛,其定量方式则是采用反相HPLC 法测定其总甜菊糖苷［9-10］。市面上存在不同用途的甜菊素，有食品级的、有药用辅料的，价格则存在十几倍差，甜菊素作为辅料添加进中成药中已无法采用容量法测定其量，本研究尝试采用HPLC 法测定其含量，为相关标准的制定提供一定的依据。

1 材料与仪器

安捷伦1260 型高效液相色谱仪，Agilent Chem Station for LC Systems 色谱工作站（DAD 检测器）；色谱柱：CAPCELL PAK C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；BT25S 型电子天平；Secura 125-1CN 电子天平。

甜菊苷对照品（批号：P15J10F90774，含量98.0%），购于上海源叶生物科技有限公司。复方鲜竹沥液（江西A 厂家，批号分别为：191203、200110、191205，江西B 厂家，批号分别为：191245、191048、191049）；阴性样品：取缺辅料甜菊素的其余各药材，按处方量及工艺自制阴性；水为去离子超纯水，乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性

色谱柱：CAPCELL PAK C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（33∶67）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：10 μL；检测波长：210 nm。理论塔板数按甜菊苷峰计算不低于4 000。

2.2 样品溶液

精密吸取本品1 mL，置10 mL 量瓶中，加50%甲醇使溶解至刻度，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.3 对照品溶液

精密称取甜菊苷对照品10.81 mg（含量为98.0%），置50 mL 量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀作为对照品溶液。

2.4 阴性对照品溶液

按复方鲜竹沥液处方，不加辅料甜菊素，按“2.2”方法制备阴性对照溶液，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

取甜菊苷对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，照“2.1”项条件试验。结果复方鲜竹沥液（无糖型）样品中呈现与甜菊苷对照品保留时间相同的色谱峰，而阴性对照则无相对应的色谱峰，无其他成分干扰，见图1。

图1 HPLC图

2.5 方法学研究

2.5.1 线性关系的考察 精密吸取“2.3”中甜菊苷对照品溶液各2、5、10、15、20、25、30 μL 进样，用安捷伦液相色谱仪进行分析，按“2.1”项下色谱条件测定甜菊苷的峰面积，以溶液质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）进行回归，线性回归方程为y=250.61x+0.977 6，R=1.000 0（n=7）。甜菊苷在0.211 9～3.178 1 μg 范围内呈良好的线性。

2.5.2 精密度试验 精密吸取“2.2.3”中甜菊苷对照品溶液10 μL，连续进行测定6 次，测定甜菊苷峰面积分别为265.3、266.8、266.2、267.2、266.7、266.1，其RSD 为0.3%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一批样品溶液（批号200110）10 μL，依次在0、5、10、12.5、15、17、30 h，重复进样，测定峰面积分别为234.5、231.2、230.2、230.9、231.3、230.5、228.6，RSD 为0.8%（n=7），结果供试品溶液中甜菊苷在30 h 内峰面积无明显变化，表明样品在30 h 内稳定。

2.5.4 重复性试验 分别精密量取同一批样品（批号为200110）5 份，照“2.1”项下方法，依法测定，其结果分别为1.872 8、1.868 8、1.877 6、1.833 0、1.901 8 mg/mL，RSD 为1.3%（n=5），结果表明该方法重复性良好。

2.5.5 加样回收试验 取样品同一批样品（批号200110），适量，混匀，分别精密吸取6 份，每份0.5 mL，分别置10 mL 量瓶中，精密加入含适量甜菊苷对照品的50%甲醇溶液5 mL，照“2.1”项下方法试验，结果测得平均回收率为99.43%（n=6），适合本品的含量测定。结果见表1。

表1 回收率试验结果

2.5.6 耐用性试验 精密吸取“2.2”项下同一批样品（批号为200110）溶液，照“2.1”项下方法测定，再分别用三种不同型号的C18柱（CAPCELL PAK C18柱、Waters Symmetry® C18 柱、GRACE AlltimaTM C18 柱）进行测定，结果甜菊苷峰在各种色谱柱均分离良好，测得含量差异无统计学意义，见表2。

表2 色谱柱考察测定结果

2.6 样品测定

取本品6 批，照“2.1”项下方法进行测定，测定结果见表3。

表3 甜菊苷的含量

3 讨论

3.1 检测方法的比较

刘景彬等［11］采用容量法与HPLC 法测定甜菊糖苷含量结果进行了比较，彭庆蕤等［12］则分别采用容量分析法、正相HPLC 法和反相HPLC 法测定总甜菊糖苷的定量分析方法比较，其中反相HPLC法受干扰小，且与实际结果较为接近。

3.2 色谱条件的选择

本研究中通过对甜菊苷在400～200 nm 波长范围内进行光谱扫描，结果为末端吸收,考虑搭配样品中峰杂质大，故以210 nm 为检测波长。通过比较甲醇-水、乙腈-水系统，在乙腈水系统下能较好的将甜菊苷与相邻的杂质峰分离，故最终确定以乙腈-水（33∶67）为流动相，在该色谱条件下，各色谱峰分离良好，峰形对称。

3.3 供试品制备方式的考察

考察了不同提取溶剂（水、甲醇、50%甲醇）、提取方式（直接稀释至刻度、超声处理），结果表明提取溶剂采用50%甲醇直接稀释即可，峰形对称。

3.4 对6 批样品结果的探讨

6 批复方鲜竹沥液（无糖型）中甜菊苷的含量测定结果从0.22～1.87 mg/mL，RSD 为77.8%，最大与最小值相差8.5 倍，同时也可以发现同一厂家所用甜菊素辅料质量是较稳定，不同厂家所用的辅料质量则相差加大。由于数据量有限，对于如何采用甜菊苷该指标来评价药用辅料甜菊素有待进一步研究。

4 结论

采用HPLC 法对复方鲜竹沥液（无糖型）中甜菊素进行定量分析。该方法快速简便、结果准确、重现性好，可用于评价复方鲜竹沥液中药用辅料甜菊素的质量。