吡拉西坦颗粒微生物限度检查方法学验证

王杰，刘澎浩邦，肖钦钦，章瑛，张春华，刘绪平

1.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中医药大学，江西 南昌 330029

吡拉西坦是一种作用于中枢神经系统的脑代谢改善药，属于γ-氨基丁酸的环形衍生物。适应证为脑动脉硬化症、脑血管意外等多种原因所致的记忆和思维功能减退，亦可用于老年精神衰退综合征、老年性痴呆、儿童智力发育迟缓等［1-5］。药品的微生物限度检查在药品质量控制和制剂安全性检查方面至关重要［6-7］。根据 2015 年版《中国药典》四部中1105、1106、1107 项下要求［8］，本实验对吡拉西坦颗粒的微生物限度检查法进行验证，并进行微生物检查，确保吡拉西坦颗粒微生物限度检查符合要求。

1 仪器与材料

1.1 1 仪器

高压蒸汽灭菌器（上海博迅实业），电子天平（北京赛多利斯），净化工作台（苏州净化有限公司），细菌培养箱（上海跃进），霉菌培养箱（上海一恒）。

1.2 材料

试药：吡拉西坦颗粒（江西亿友药业有限公司，批号20180402、20180403、20180404，规格：5 g∶2.4 g），pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号200719，北京陆桥）。

培养基：麦康凯液体培养基（批号171103），胰酪大豆胨琼脂培养基（批号110422），胰酪大豆胨液体培养基（批号170112），沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号170615），麦康凯琼脂培养基（批号171114），沙氏葡萄糖液体培养基（批号170811），以上培养基均来自北京陆桥。

菌种：金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］，枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］，铜绿假单胞菌［CMCC（B）10104］，白色念珠菌［CMCC（F）98001］，黑曲霉［CMCC（F）98003］，大肠埃希菌［CMCC（B）44102］，均来源于中国食品药品检定研究院，所用均为2 代菌株。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备

按照《中国药典》2015 年版四部通则1105 检查项中的方法，将各试验菌制成适宜浓度的菌液。

2.2 微生物限度检查方法验证

2.2.1 供试液制备1∶10 供试液 取吡拉西坦颗粒10 g，置无菌锥形瓶中，加入稀释液（pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）至100 mL，振摇溶解，即得。

2.2.2 计数方法适用性试验试验组 取配制的1∶10的供试液5 份，每份9.9 mL，每份中加入试验菌液0.1 mL，使供试液中含菌量不大于100 cfu/mL。取上述试液注入2 个平皿，使每个平皿1 mL，每个平皿加入胰酪大豆胨琼脂培养基，再将平皿置33 ℃培养箱培养；取配制的1∶10 的供试液2 份，每份9.9 mL，每份中加入试验菌液0.1 mL，使供试液中含菌量不大于100 cfu/mL。取上述试液注入2个平皿，使每个平皿1 mL，每个平皿加入沙氏葡萄糖琼脂培养基，再将平皿置23 ℃培养箱培养。供试品对照组：稀释液代替菌液，其他操作同试验组。菌液对照组：以稀释液替代供试液，其他操作同试验组。

回收比值计算如下：回收比值=(试验组菌落数-供试品对照组菌落数)/菌液对照组菌落数。计算结果见表1 与表2。可见，采用常规法，各实验菌回收率均在0.5～2.0 的范围内，表明该微生物限度检查方法符合2015 年版《中国药典》微生物限度检查的验证要求［9］。

表1 需氧菌总数验证结果

表2 霉菌和酵母菌总数验证结果

2.3 控制菌（大肠埃希菌）检查

试验组：取1∶10 的供试液10 mL，置锥形瓶中，加入胰酪大豆胨液体培养基100 mL，加入小于100 cfu 的大肠埃希菌液，置33 ℃培养箱培养24 h，取上述培养物1 mL，置加有100 mL 麦康凯液体培养基的无菌锥形瓶中，置42 ℃培养箱中培养48 h。用接种环取上述培养物通过划线法，将其接种于麦康凯琼脂平板上，置33 ℃培养箱中培养72 h，观察结果。菌液对照组：以稀释液代替供试品溶液，其它同试验组。供试品组：以等量稀释液替换菌液，其它和试验组同法操作。稀释液组：以等量稀释液替换供试品溶液，并且不加菌液至锥形瓶中，其它和试验组同法操作。

结果：试验组和菌液对照组的麦康凯琼脂平板上有大肠埃希菌生长，供试品对照组和阴性对照组的麦康凯琼脂平板上均无菌生长。表明吡拉西坦颗粒在该条件下，对大肠埃希菌无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计。说明可以采用该法进行吡拉西坦颗粒的大肠埃希菌检查。

2.4 样品微生物限度检查

采用常规法对三批吡拉西坦颗粒进行需氧菌总数的检查、霉菌和酵母菌总数及控制菌的检查，结果见表3。结果表明，建立的检查方法可用于吡拉西坦颗粒微生物限度的检查。

表3 3批样品微生物限度检查结果

3 讨论

在药品的生产、包装、运输、存储等环节中，一些外在的因素会造成微生物对药品的污染，进而对人体造成各种危害［11］，药品微生物限度检查的过程中，检验环境以及检测人员等都会对实验结果产生影响，同时操作步骤较多，因此在考虑到吡拉西坦本身无抑菌性，因此用平皿法进行微生物检查并进行方法学验证，以减少可能造成的污染，从而确保检验方法的准确性［12］。

吡拉西坦是一种作用于中枢神经系统的脑代谢改善药，属于γ-氨基丁酸的环形衍生物，具有保护及修复脑细胞的作用，改善脑代谢，增加脑血流量，改善脑神经功能。结合其化学结构，初步判断本品无抑菌性，为确保常规法配制的溶液不抑制实验菌的生长，本研究对检验方法进行了回收率实验，结果表明1∶10 的供试液各实验菌回收比值均符合规定［10］。采用常规法作为本品的微生物的检查方法是可行的。