HPLC 法测定氧氟沙星凝胶中三种抑菌剂的含量

马帅，王超之，刘枕，高新贞

淄博市食品药品检验研究院，山东 淄博 255086

氧氟沙星为喹诺酮类抗菌药［1］，通过抑制细菌的 DNA 旋转酶从而抑制 DNA 复制而发挥作用。具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点，对革兰阳性菌、阴性菌群均有较强的抗菌作用。氧氟沙星凝胶用于敏感细菌所致的皮肤软组织细菌感染性疾病，如毛囊炎、疖肿、脓疱疮，外伤感染及湿疹感染等［2］。由于凝胶剂具有涂展性好、易于清洗、透皮吸收性能好等突出的优势，其应用范围越来越广泛［3］。《中国药典》2020 年版四部［4］规定了多剂量凝胶制剂一般应添加适当抑菌剂，但笔者尚未发现氧氟沙星凝胶中抑菌剂进行测定的报道。氧氟沙星凝胶共有10 个批准文号，本次研究涉及4 个批准文号，即四个厂家生产的氧氟沙星凝胶，在说明书或包装盒均未标识抑菌剂种类和含量。为了更好的控制氧氟沙星凝胶的质量，本研究在参考文献基础上，建立了HPLC 法测定氧氟沙星凝胶中三种抑菌剂含量的方法［5-10］。

1 仪器与试药

LC-20AT 高效液相色谱仪，SPD-20A UV/VIS检测器（日本岛津公司）；METTLER AE240 电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KS-300E 超声波清洗机（宁波科生仪器厂）。

对照品：羟苯甲酯（中国食品药品检定研究院，批号：100278-201705，含量为100.0%）、羟苯乙酯（中国食品药品检定研究院，批号：100847-201604，含量为99.9%）、羟苯丙酯（中国食品药品检定研究院，批号：100444-201403，含量为99.6%）；样品涉及4 个厂家的4 个批号（编号为厂家01～04；批号：1912031、191102、200911、200639；批准文号：H20065834、H32024996、H20083392、H20 103273；规格：20 g/支、15 g/支、20 g/支、15 g/支）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm；5 μm）；流动相为甲醇-1%冰醋酸溶液（60∶40），流速为1.0 mL/min，柱温：35 ℃，检测波长254 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取羟苯甲酯（10.10 mg）、羟苯乙酯（10.12 mg）、羟苯丙酯（10.25 mg），分别置于50 mL 容量瓶中，加流动相稀释定容，得对照品储备液。分别取羟苯甲酯储备液300 μL、羟苯乙酯储备液400 μL、羟苯丙酯储备液600 μL置于50 mL 容量瓶，加流动相稀释定容，得混合对照品溶液（羟苯甲酯1.212 μg/mL、羟苯乙酯1.618 μg/ mL、羟苯丙酯2.450 μg/ mL）。取混合对照品溶液10.0 mL 至50 mL 容量瓶，流动相稀释定容，作为对照品溶液（羟苯甲酯0.242 μg/ mL、羟苯乙酯0.324 μg/ mL、羟苯丙酯0.490 μg/ mL）。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量，取约25 mg，精密称定，置于25 mL 容量瓶中，加少量流动相稀释，超声处理20 min，放冷，加流动相定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 系统适用性试验

分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图（图1）。

图1 系统适用性试验：A.对照品；B.样品（厂家01）

2.4 线性关系考察

分别取混合对照品溶液0.4、2.0、10.0、25.0至50 mL 容量瓶，流动相稀释定容。与混合对照品溶液组成5 个不同浓度的标准曲线工作溶液。以对照品进样浓度（μg/mL）为横坐标，以对照品峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。取仪器信噪比10∶1 时进样量为各成分的定量限，信噪比为3∶1 时进样量为各成分的检出限。回归方程、线性范围、定量限及检出限见表1。

表1 线性关系、检测限、定量限结果

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下的对照品溶液连续进样6 次，结果羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯的RSD 分别为0.41%、0.57%、0.24%，表明结果良好。

2.6 重复性试验

取同一批样品（厂家01），按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法，平行制备6 份；按2.1 项下色谱条件测定。结果羟苯甲酯、羟苯丙酯未检出，羟苯乙酯RSD 为1.66%，试验结果表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.1”项下的对照品溶液及供试品溶液（厂家01）置室温下放置，分别在0、2、4、8、16、24 h 各进样10 μL，测定对照品溶液中的羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯RSD 分别为0.39%、0.27%、0.28%，供试品溶液中的羟苯乙酯RSD 为0.29%，表明溶液在24 h 内稳定。

2.8 加样回收试验

精密称取供试品（厂家01）约65 mg，至100 mL 容量瓶，加少量流动相稀释，超声处理20 min，放冷，加流动相定容至刻度，摇匀，滤过，流动相定容至刻度，精密量取续滤液5 mL 至10 mL 容量瓶，分别精密加混合对照品溶液1.8、2.0、2.4 mL，流动相定容至刻度，每个浓度平行3 份。结果见表2。

表2 回收率的试验结果

2.9 样品测定

取四批样品，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，结果见表3。

表3 样品含量测定结果

3 讨论

羟苯甲酯、乙酯、丙酯是广谱型抗菌防腐剂，在药物制剂中得到了广泛的应用［11-12］。抑菌剂使用量不足，会增加微生物污染的风险，如使用量过多，会产生毒性。因此，抑菌剂的合理使用和质量控制已经成为保证药物安全性、有效性的关键问题之一［13］。不同生产企业的氧氟沙星凝胶均只标明主成分，未注明辅料、防腐剂或抑菌剂的种类和含量。不同抑菌剂抑菌作用不同，抑菌能力会有很大变化，抑菌剂存在过度或缺失添加的风险。建议生产企业产品说明书中标注使用的抑菌剂种类及含量，便于临床用药的选择。

本试验分别以PhenomenexOOG-4435EO C18（4.6 mm×250 mm；5 μm）和Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm；5 μm）两种色谱柱进行试验，发现均可对样品进行有效分离，且峰型良好。最终选择Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm；5 μm）为本试验的色谱柱。

参考2020 年版《中国药典》四部药用辅料标准［4］，羟苯甲酯、羟苯乙酯及羟苯甲酯在流动相为甲醇-1%冰醋酸溶液（60∶40），检测波长254 nm的色谱条件下各组分峰与相邻色谱峰的分离效果良好，且保留时间适中，可作为抑菌剂的含量测定方法。

氧氟沙星凝胶为半固体制剂，尝试了水、甲醇等做提取溶剂，以流动相作为提取溶剂效果最好。

该研究建立了高效液相色谱法对三种菌剂同时进行测定，能有效检测氧氟沙星凝胶中抑菌剂的加入量，提高检验效率，为减少不良反应的发生提供可靠保证。