雨生红球藻破壁孢子粉对Ⅱ型糖尿病大鼠肝肾的保护作用

毕萃萃，刘银路，杨丽涛，魏芬芬，李勇超，张 波

(北京联合大学，生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京100191)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性疾病，是全世界公认的严重危害人类健康的公共卫生问题［1－2］。糖尿病分为Ⅰ型糖尿病(Type 1 diabetes，T1DM)和Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes，T2DM)，T1DM发病原因主要是由于胰岛β细胞受损，从而导致机体胰岛素分泌不足，常表现为依赖或需要胰岛素治疗［3］。T2DM是由多因素引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，伴有因胰岛素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢异常，该病有“三多一少”典型症状。其中T2DM的发病率约为90%。研究表明糖尿病与氧化应激关系密切［4］。Ⅱ型糖尿病患者发病机理复杂，其常伴随着肾脏、肝脏、心脏和血管等多个器官功能的衰竭，长期糖尿病导致微血管血糖升高。糖尿病最主要的并发症为糖尿病肝病和糖尿病肾病，主要症状为长期的高血糖、高血压和蛋白尿，严重时将恶化为肝硬化和肾衰竭，严重危害人类健康，尚无根治药物［5－7］。目前市面上调节糖尿病代谢的抗氧化剂补充剂有维生素C和维生素E等。刘芬［8］研究了不同抗氧化剂对2型糖尿病的调节作用，实验结果表明相较于其他抗氧化剂，不同剂量的虾青素不仅可有效预防2型糖尿病，更有助于调节甘油三酯和体重的下降。故研究虾青素对糖尿病肝病和糖尿病肾病的保护作用有积极意义。

雨生红球藻为团藻目红球藻科红球藻属植物，又名湖生红球藻或湖生血球藻，广泛存在于自然界中［9］。雨生红球藻厚壁孢子经高压均质等技术操作得到雨生红球藻破壁孢子粉(Sporoderm－broken Spore Powder of Haematococcus pluvialis)，其虾青素含量极高，是公认的天然虾青素的最好来源［10－12］。虾青素因其化学结构具有较强活性功能，如抗氧化、抗衰老、增强免疫力等，常用于保健食品等领域［13－15］。研究表明，虾青素是自然界迄今为止发现的最强大的天然抗氧化剂之一，具有清除机体自由基、增加抗氧化酶活性、减少衰老细胞堆积和增强细胞再生能力等重要作用［16－20］。本文主要研究雨生红球藻破壁孢子粉对Ⅱ型糖尿病大鼠的肝肾的保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雄性SD大鼠 (许可证编号:SCXK(京)2012－0001)，体质量180±20 g，SPF级，中国食品药品检定研究院;雨生红球藻破壁孢子粉(虾青素含量为2%)杭州鑫伟低碳技术研发公司提供;链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)美国Sigma公司;盐酸二甲双胍 华裕制药有限公司;0.1 mmol/L柠檬酸缓冲溶液 北京鼎国昌盛生物技术有限公司;蛋白定量测试盒、丙二醛(MDA)测试盒、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;大鼠白介素－1β(IL－1β)酶联免疫试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子(TNF－α)酶联免疫试剂盒 上海沪尚生物科技有限公司。

电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;5804R型高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;电动匀浆器 常州朗越仪器制造有限公司;UV－2450紫外可见分光光度计 日本津岛仪器有限公司;CP324S型电子天平 德国Sartorius公司;ZRXQ003T0型超级应用型纯水器 美国Millipore公司;7180型全自动生化分析仪 日本日立高新技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与饲养 现将84只SPF级SD雄性大鼠适应性喂养3 d后分为正常组和造模组。正常组普通饲料饲养，造模组高脂高糖饲料饲养。4周后，造模组70只大鼠腹腔注射一次链脲佐菌素(STZ)35 mg/kg BW;继续饲养4周，测血糖将造模成功大鼠再分为模型组、低剂量组(50 mg/kg BW)、中剂量组(100 mg/kg BW)、高剂量组(200 mg/kg BW)、降糖药物组(28.5 mg/kg BW)，每组12只大鼠(造模期间有60只大鼠造模成功，为统一每组大鼠均为12只)。试验性大鼠在SPF屏障系统中饲养，温度控制在(20±2)℃，空气相对湿度50%～70%，光照周期为14 h光照(6:00～20:00)/10 h黑暗，自由取食、饮水。

1.2.2 糖尿病模型的建立和雨生红球藻破壁孢子粉的灌胃 SPF级SD雄性大鼠饲养4周后，正常组腹腔注射0.1 mmol/L柠檬酸缓冲溶液，造模组腹腔注射一次链脲佐菌素(STZ)35 mg/kg BW，继续饲养4周，眼眶取血测空腹血糖值，大于11.1 mmol/L则Ⅱ型糖尿病模型成功。正常组大鼠每日给予蒸馏水和普通饲料饲养。低、中、高三个剂量组分别给予50、100、200 mg/kg BW的雨生红球藻破壁孢子粉灌胃，降糖药物组给予28.5 mg/kg BW的盐酸二甲双胍灌胃，模型组给予蒸馏水，同时继续高脂高糖饲料饲养4周。

1.2.3 指标观察与测定

1.2.3.1 血清指标 测定处死大鼠，取血离心，得到的血清放入－80℃冰箱中用于血糖等指标的测定。采用全自动分析仪检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)活性及白蛋白(ALB)和球蛋白(GLO)含量。

1.2.3.2 肝肾组织抗氧化指标测定 处死大鼠后，取肝脏、肾脏放入－80℃冰箱中用于肝肾组织相关指标的测定。将大鼠肝、肾组织从－80℃冰箱中取出，与0.9%生理盐水按照1∶9的比例混合，制成10%匀浆液，3000 r/min离心10 min取上清，待用。分别取肝肾组织的匀浆液测定SOD、GSH－Px活性和丙二醛MDA含量，测定过程严格按照南京建成生物工程研究所相关试剂盒说明书操作。SOD检测表示每mg蛋白质中SOD的活力，单位为U/(mg prot)，GSH－Px的单位为mg GSH/(mg prot)，MDA检测为每mg蛋白质中MDA的含量，单位为mmol/(mg prot)。

1.2.3.3 肝肾组织炎性因子测定 用稀释好的5%的组织匀浆离心取上清，按照生物素双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒测定TNF－α和IL－1β含量。

1.2.3.4 肝、肾病理学观察 处死大鼠，取肝脏、肾脏于10%中性多聚甲醛固定液中保存待用。取固定液中的肝、肾组织块，经酒精梯度脱水、石蜡包埋、切片、染色之后，于光学显微镜下观察肝细胞的形态变化、炎症反应、纤维化、脂肪空泡等病理改变。

1.3 数据处理

实验数据采用SPSS 12.0软件进行统计分析，各组数据结果以平均值±标准差()表示，两组间均值比较采用t检验分析方法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 雨生红球藻破壁孢子粉对Ⅱ型糖尿病大鼠血清相关指标的影响

由表1可知，与正常组相比，模型组大鼠的ALT、AST活性极显著升高(P＜0.01)，超出正常范围。ALT和AST是两个肝功能的重要指标，ALT异常说明有肝变性硬化和肝炎等的可能，AST异常说明有肝细胞坏死和肝硬化的可能［21－22］，而模型组中两项指标均异常，说明大鼠肝脏功能受损。除低剂量组外，高、中剂量组的雨生红球藻破壁孢子粉干预后，ALT、AST活性与模型组比较显著降低(P＜0.01)，说明雨生红球藻破壁孢子粉对肝脏有一定的调节作用。高剂量组与正常组比较无显著差异(P＞0.05)，说明雨生红球藻破壁孢子粉对糖尿病大鼠两个肝功能重要指标ALT、AST的改善作用明显。高剂量组与降糖药物组相比ALT、AST极显著降低(P＜0.01)，说明高剂量组强于二甲双胍的作用。

ALP是一种磷酸单酯酶，肝硬化、黄疸者中的ALP过高，重症慢性肾炎者中的ALP偏低，故作为肝肾疾病的重要指标。LDH常见于急性肝细胞损伤等［23］。模型组大鼠血清ALP、LDH活性极显著高于正常组大鼠(P＜0.01)，低剂量组中的LDH与模型组无显著性差异(P＞0.05)，ALP与模型组有极显著性差异(P＜0.01)，高、中剂量组雨生红球藻破壁孢子粉干预后大鼠血清ALP和LDH活性均极显著低于模型组(P＜0.01)，且存在雨生红球藻破壁孢子粉优于二甲双胍(P＜0.05，P＜0.01)的情况。说明雨生红球藻破壁孢子粉对Ⅱ型糖尿病大鼠的肝和肾功能或有一定的改善作用。

ALB、GLO通常作为肾脏疾病的指标，因为肾功能不全易导致白蛋白和球蛋白的流失，形成尿蛋白［24］。模型组大鼠的ALB、GLO极显著高于正常组大鼠(P＜0.01)，说明模型组大鼠的肾功能可能出现问题。与模型组大鼠比较，低剂量组ALB和GLO均无显著性差异(P＞0.05)，中剂量组ALB无显著性差异(P＞0.05)，GLO有显著性差异(P＜0.05)，高剂量组雨生红球藻破壁孢子粉干预后ALB、GLO含量显著降低(P＜0.05，P＜0.01)。说明雨生红球藻破壁孢子粉对ALB和GLO含量也会产生一定的影响，进而改善肾功能。

2.2 雨生红球藻破壁孢子粉对Ⅱ型糖尿病大鼠肝肾抗氧化指标的影响

SOD、GSH－Px和MDA为常见的抗氧化检测指标。SOD和GSH－Px可有效清除体内自由基，有效防止脂质过氧化，MDA是自由基作用于脂质发生氧化反应的最终产物，有一定毒性，会引起核酸、蛋白质等大分子的交联聚合，从一定程度上反映了糖尿病的机理［25］。由表2可知，与正常组相比，模型组大鼠肝肾组织MDA含量极显著升高(P＜0.01)，SOD和GSH－Px活性极显著降低(P＜0.01)，说明模型组大鼠肝肾有一定程度的损伤。与模型组相比，雨生红球藻破壁孢子粉干预后，各组MDA含量显著降低(P＜0.01，P＜0.05)，SOD活性极显著升高(P＜0.01)。高剂量组的GSH－Px活性极显著升高(P＜0.01)，中剂量组肝脏的GSH－Px活性极显著升高(P＜0.01)，肾脏中的GSH－Px活性与模型组无显著性差异(P＞0.05)，低剂量组与模型组无显著性差异(P＞0.05)。雨生红球藻破壁孢子粉对体内氧化反应有一定缓解作用。且高剂量的雨生红球藻破壁孢子粉效果极显著优于二甲双胍(P＜0.01)。

表1 雨生红球藻破壁孢子粉对Ⅱ型糖尿病大鼠血清相关指标的影响(n=12)Table 1 Influences of sporoderm－broken spore powder of Haematoccus pluvialis to indicators related to serum of diabetes model rats(n=12)

表2 雨生红球藻破壁孢子粉对Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏和肾脏SOD，GSH－Px，and MDA的影响(n=12)Table 2 Influences of sporoderm－broken spore powder of Haematoccus pluvialis on SOD，GSH－Px，and MDA of liver and kidney of diabetes model rats(n=12)

表3 雨生红球藻破壁孢子粉对Ⅱ型糖尿病大鼠肝肾组织TNF－α、IL－1β含量的影响(n=12)Table 3 Effect of sporoderm－broken spore powder of Haematoccus pluvialis on IL－1β，TNF－αof liver and kidney in diabetic rats(n=12)

2.3 雨生红球藻破壁孢子粉对Ⅱ型糖尿病大鼠肝肾组织TNF－α、IL－1β含量的影响

IL－1β和TNF－α为常见的细胞炎性因子，白细胞介素和肿瘤坏死因子在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T细胞和B细胞活化、增殖与分化中起重要作用，也是重要的炎症因子［26］。由表3可知，与正常组相比，模型组大鼠肝肾组织的IL－1β和TNF－α含量极显著升高(P＜0.01)，与模型组大鼠相比，雨生红球藻破壁孢子粉低剂量组IL－1β和TNF－α含量无显著性差异(P＞0.05)，中剂量组肝脏的IL－1β含量有显著性差异(P＜0.05)，TNF－α含量无显著性差异(P＞0.05)，肾脏的IL－1β和TNF－α含量极显著降低(P＜0.01)，高剂量组IL－1β和TNF－α含量均极显著降低(P＜0.01)，且高剂量的雨生红球藻破壁孢子粉效果优于二甲双胍。炎性因子含量越多说明体内的炎症反应情况越严重，而肝肾中的炎症反应在一定程度上体现了其肝肾功能，实验结果表明雨生红球藻破壁孢子粉对大鼠肝肾有一定的改善作用。

2.4 雨生红球藻破壁孢子粉对Ⅱ型糖尿病大鼠肝肾组织病理切片的影响

由图1可知，正常组可见清晰中央静脉，肝窦和细胞索排列正常，且肝小叶分界清晰可见，肝细胞胞质均匀且无颗粒和脂肪变性，无纤维化(图1a);模型组大鼠肝组织中央静脉结构不完整，肝细胞索和肝窦排列无规律不规则，部分肝细胞肿胀且有轻度变形，细胞核浓缩，胞质颗粒变性，肝中央静脉有淤血现象(图1b)。雨生红球藻破壁孢子粉高剂量组肝组织中央静脉清晰，肝细胞索排列较正常(图1c)。由图1可以看出，随着雨生红球藻破壁孢子粉剂量增大，糖尿病引起的肝脏损伤的改善作用也越来越显著。

由图1可知，正常组肾脏组织结构清晰，肾小球、肾小管结构完整且排列规则，肾小球基底膜未见异常，肾小管结构无明显纤维化，肾小囊体积、囊腔腔隙正常，近曲小管上皮细胞结构正常(图1g)。模型组肾小囊囊腔变小，系膜内浆液浸润，肾小球体积变大且系膜增厚，系膜细胞增生严重，局部出现肾小球硬化;肾小管出现上皮细胞脱落，出现扩张，萎缩(图1h)。雨生红球藻破壁孢子粉高剂量组肾脏组织结构较明显，囊腔腔隙较正常，肾小球、肾小管结构较正常(图1i)。由图1可以看出，随着雨生红球藻破壁孢子粉剂量的增大，糖尿病引起的肾脏损伤的改善作用也越来越显著。

3 讨论与结论

图1 雨生红球藻破壁孢子粉对大鼠肝肾组织病理切片的影响(HE，400×)Fig.1 Effects of sporoderm－broken spore powder of Haematoccus pluvialis on pathological injury of liver and kidney in diabetic rats(HE，400×)

糖尿病肝病和糖尿病肾病是糖尿病引起的重要器官损伤［27－31］。糖尿病肝病是糖尿病的一种慢性并发症，主要表现为肝糖原沉积、肝内脂肪滴增多且出现脂肪变性、非特异性细胞变性如肝细胞水肿以及肝硬化等。糖尿病肾病是糖尿病的重要并发症之一，是导致终末期肾衰竭，引起死亡的主要原因之一。其主要的特征是蛋白尿、肾小球肥大、肾小管滤过率低和肾脏纤维化等肾小球和肾小管结构和功能改变［32－33］。研究发现，持续高血糖是糖尿病肾病中代谢和血管异常的主要原因，持续的高血糖引起的机体大量活性氧自由基产生，进而引起氧化应激反应，是糖尿病肾病发生发展的关键因素之一。同时研究还发现，给予抗氧化剂治疗可显著抑制糖尿病肾病的肾脏产生氧化应激反应，显著减轻糖尿病肾病肾脏组织的纤维化程度［34－35］。前期研究了雨生红球藻源虾青素对糖尿病小鼠的降糖作用以及雨生红球藻破壁孢子粉对小鼠酒精性肝肾损伤的保护作用，结果均显示良好，且糖尿病会引发肝肾损伤，故在糖尿病的基础上研究雨生红球藻破壁孢子粉对肝肾损伤的保护作用有重要的研究意义［36－38］。本研究中，通过高脂高糖饮食并注射STZ后血糖值大于11.1 mmol/L，制造Ⅱ型糖尿病模型［39］。模型组大鼠血清中与肝脏功能密切相关的酶如ALT、AST、LDH、ALP活性均极显著升高(P＜0.01)，肝肾组织的SOD、GSH－Px的酶活性极显著降低(P＜0.01)，MDA含量极显著升高(P＜0.01)，提示肝肾功能可能受到损害。经口给予高剂量雨生红球藻破壁孢子粉后，Ⅱ型糖尿病大鼠肝肾脏组织ALT、AST、ALP、LDH、ALB、GLO均显著降低(P＜0.05)，同时，肝肾组织的SOD、GSH－Px酶活性极显著升高、MDA含量极显著降低(P＜0.01)，说明雨生红球藻破壁孢子粉对高脂高糖饮食并注射STZ的Ⅱ型糖尿病大鼠的肝肾损害有一定的缓解作用。肝肾组织病理切片也表明，经口给予雨生红球藻破壁孢子粉可显著改善肝组织形态、肝细胞索和肝窦排列，显著改善肾小球、肾小管组织状态，囊腔腔隙结构等。综上所述，经口给予雨生红球藻破壁孢子粉，可显著改善高糖高脂Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏和肾脏的结构和功能。雨生红球藻可辅助治疗高脂高糖引起的Ⅱ型糖尿病。但目前机理尚不明确，有待于进一步研究。