黔产皂角米多糖提取动力学及抗氧化活性研究

付 金，姚秋萍，邓水秀，谭承建

(贵州民族大学化学工程学院，贵州贵阳550025)

皂角米又称皂角仁、皂角精，是皂荚的种子，含有半乳甘露聚糖［1］，是一种高蛋白、低糖、氨基酸齐全和矿质元素丰富，符合高K低Na饮食结构的营养保健食物［2］。此外，皂角还有一定的生物活性。如抗菌活性、杀虫活性、抗病毒活性等［3］。杨向颖等［4］从皂荚中分离出一种具有杀鼠活性的三萜皂苷。Dai等［5］发现皂角70%乙醇提取物具有抗过敏和抗炎活性。Peng等［6］研究皂角果提取物，发现其可以通过抗高血脂活性有效地减轻动脉粥样硬化，具有治疗高脂血症相关的心血管疾病的治疗潜力。

近年来，皂角多糖资源的开发利用受到国内外学者的普遍关注，余铭等［7］用皂角米多糖溶液涂膜对比PE膜包装处理对甜柿果果仁贮藏保鲜效果的研究发现，皂角米多糖具有类似PE膜包装的保鲜效果，可作为一种新型的果实涂膜保鲜材料。Gao等［8］用皂角米多糖合成热敏接枝聚合物，并对其进行结构表征。Hou等［9］通过美拉德反应，用酶蛋白疏水肽对皂角多糖进行疏水改性，制备了一种新型的皂角胶基乳化剂。Pradeep等［10］报道了皂角多糖具有抗大鼠糖尿病及其并发症的作用。Sun等［11］报道了皂角米多糖能有效降低淀粉的消化率和葡萄糖扩散速率，通过体内实验证实皂角米多糖可以降低含淀粉食品的升糖指数，并抑制餐后血糖水平的激增。皂角米多糖因具有增稠、黏合、稳定等特点在食品医药［12］、石油钻探［13］、造纸［14］、涂料［15］等行业得到广泛应用。多糖作为皂荚的功能性成分之一，其提取工艺以及动力学研究在工业生产中尤为重要。目前已报道的皂角米多糖提取方法主要有水提醇沉、超声波辅助提取等［16］，对于提取采用动力学模型方面的研究未见报道。

本实验以贵州省毕节地区的皂角米为研究对象，采用Fick第一定律建立黔产皂角米多糖提取动力学模型，通过红外分析对其结构进行表征，通过测定皂角米多糖对2，2－联氮－二(3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸)二铵盐(ABTS)、羟基自由基、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)、超氧阴离子自由基的清除能力来评价其抗氧化活性，以期为皂角米多糖的规模化提取以及皂荚高价值产品研发提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

皂角米 购于贵州毕节;苯酚、葡萄糖、过氧化氢、抗坏血酸、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、硫酸亚铁、水杨酸、盐酸、硫酸等 均为分析纯;2，2－联氮－二(3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸)二铵盐(ABTS)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)梯希爱上海化成工业发展有限公司;中性蛋白酶 北京索莱宝科技有限公司。

JA5003电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;RE－2000A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;TDL－8M离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司;FD5－3P真空冷冻干燥机 美国SIM;TU－1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;Nicolet6700傅里叶红外光谱仪 上海莱睿科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 皂角米多糖提取 将皂角米粉碎，过60目筛，精确称量5.00 g于烧杯中，加入比例为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60的蒸馏水，再加入2.50 g中性蛋白酶(蛋白酶活力50000 U/g)，搅拌均匀，室温过夜，在328、333、338、343、348、353 K下回流60、75、90、105、120、135 min，抽滤，上清液加入200 mL无水乙醇，4℃静置过夜，4000 r/min离心获得沉淀，沉淀用蒸馏水溶解，于－52℃下冷冻干燥24 h，即得皂角米多糖。

1.2.2 皂角米多糖含量的测定 采用苯酚－硫酸法［17］测定皂角米多糖含量。配制浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液，精密量取葡糖糖标准溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL于10 mL试管中，用蒸馏水补充至2 mL，沿管壁加入浓度为5%苯酚溶液1 mL，再加入5 mL浓硫酸，充分振摇，水浴10 min，静置至室温，于490 nm波长下测定吸光度值，作皂角米多糖浓度对吸光度关系图。得到回归方程为:y=6.05x－0.0903，线性范围0.05～0.25 mg/mL，决定系数R2为0.9989。量取0.1 mL皂角米多糖溶液，按照上述方法操作，以下式计算多糖含量。

其中，C为样品溶液中多糖浓度(mg/mL);V为样品溶液体积(mL);F为稀释倍数;M为样品质量(g)。

1.2.3 多糖提取动力学研究 一般认为，多糖在提取过程中分为三个过程，提取液向物料内部渗透［18］、有效成分溶解于提取液中［19］、有效成分向皂角米表面扩散以及由皂角米表面扩散至主体溶剂中［20］。假设粉碎后皂角米颗粒为球形，且形状均匀［21］，整个提取过程中形态不变，多糖成分只向同一方向扩散，扩散系数恒定且均相温度保持不变［22］。设皂角米颗粒半径为R，表面扩散系数为Ds，由Fick第一定律得:

设提取接近平衡时提取溶液中多糖浓度为C∞，提取溶液中皂角米多糖初始浓度为C0，根据傅里叶变换求得［23］:

通常情况下，浓度的分布式为无限级数，高次项分布趋近于0，可忽略，上式取n=1，则

式(4)左右两边同时取对数得:

式(4)、(5)为皂角米多糖提取动力学模型，该模型反映了皂角米多糖提取过程中提取时间、提取温度、料液比等参数对多糖浓度的影响。

1.2.4 皂角米多糖红外光谱分析 称取3 mg皂角米多糖与干燥的0.3 g KBr在玛瑙研磨钵中顺时针研磨2 min，压为薄片，于红外光谱仪中进行光谱扫描，波数范围为4000～400 cm－1［24］。

1.2.5 皂角米多糖抗氧化活性研究

1.2.5.1 皂角米多糖对ABTS阳离子自由基的清除活性 参照Durmaz等［25］报道的方法制备ABTS样液，取过硫酸钾(2.6 mmol/L)于2 mL ABTS(7.4 mmol/L)中，混匀，室温避光静置12 h，取5 mL上述样液于10 mL容量瓶中，分别加入一定浓度(0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)的皂角米多糖溶液，室温避光静置20 min，于752 nm测定吸光度，以VC(浓度为0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)作为对照。计算公式为:

式中，A0为空白对照组，A1样品组。

1.2.5.2 皂角米多糖对羟基自由基的清除活性 参照李粉玲等［26］报道的方法，配制0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL的皂角米多糖溶液。取以上溶液各1 mL，加入9 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L水杨酸－乙醇1 mL，再加入8.8 mol/L H2O21 mL启动反应，37℃水浴30 min，在510 nm处测量吸光度，以VC(浓度为0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)作为对照。计算公式为:

式中，A0为空白对照液的吸光度值;AX为加入多糖后的吸光度值;AX0为不加过氧化氢引发反应的吸光度值。

1.2.5.3 皂角米多糖对DPPH自由基的清除活性 参照李亚辉等［27］的方法，取5 mL浓度为5 mmol/L的DPPH－无水乙醇溶液(备用液)，加入到不同浓度的多糖(浓度为0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)溶液中，振摇，室温暗处放置30 min，于517 nm测定吸光度，以VC(浓度为0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)作为对照。计算公式为:

式中，A0为备用液的吸光度，A1为备用液和多糖的吸光度，A2为无水乙醇和多糖吸光度。

1.2.5.4 皂角米多糖对超氧阴离子自由基的清除活性 参考罗敬文等［28］报道的方法，取1 mL去离子水于50 mmol/L Tris－HCl缓冲液中，混合均匀，水浴(25℃)20 min，加入1.0 mL不同浓度的多糖(浓度为0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)与6 mmol/L 25℃预热的邻苯三酚0.1 mL，振摇混匀，水浴(25℃)5 min，加入0.5 mL 10 mmol/L HCl终止反应。于420 nm处测定吸光值，以VC(浓度为0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)作为对照。计算公式为:

式中，K0为空白样品的平均吸光度值，K1为式样的平均吸光度值。

1.3 数据处理

所有实验数据重复3次，取平均值。用Graph Pad Prism 8.0.1(244)绘图。

2 结果与分析

2.1 提取动力学模型的建立

2.1.1 提取速率常数k 由图1可看出，皂角米多糖浓度和提取温度、提取时间成正比关系。当提取时间达到120 min后，多糖浓度变化较小，135 min后基本平衡;相同的提取时间下，提取温度越高，多糖浓度越大;相同提取温度下，提取时间越长，析出的多糖越多，浓度越大。由图2可看出，相同提取时间条件下，料液比越大，则多糖浓度越大，一定范围内，增大料液比有助于多糖提取;相同料液比条件下，提取时间越长，多糖浓度越大，一定范围内，升高温度有助于多糖提取。相同料液比条件下，当提取时间达120 min后，多糖浓度变化较小，135 min时基本达到平衡。在温度为353 K，提取时间为135 min时，皂角米多糖得率为7.1%。

图1 不同温度条件下多糖浓度随时间变化趋势Fig.1 Changes of polysaccharide concentration with time under different temperature conditions

图2 不同料液比条件下多糖浓度随时间变化趋势Fig.2 Variation of polysaccharide concentration with time under different material－liquid ratios

利用图1、图2中的变化趋势作ln［C∞/(C∞－C)］对t的关系图，见图3，所得的关系曲线和表观速率常数k见表1、表2。

由表1、表2得出，不同提取条件下的ln［C∞/(C∞－C)］与t线性关系良好，系数R2均大于0.90。表观速率常数k与提取时间和料液比成正比。

2.1.2 相对萃余率 皂角米在提取前虽浸泡，但其溶于水中的多糖较少，可忽略。取初始浓度C0=0，设相对萃余率y=(C∞－C)/C∞，则式(5)变为y=(6/π2)exp(－kt)。在图1、图2数据的基础上，作相对萃余率(C∞－C)/C∞对提取时间t关系图(图4)。

表1 不同提取温度下ln［C∞/(C∞－C)］与时间t的回归结果Table 1 Regression results between ln［C∞/(C∞－C)］and t at different temperatures

表2 不同料液比时ln［C∞/(C∞－C)］与时间t的回归结果Table 2 Regression results between ln［C∞/(C∞－C)］and t at different solid－liquid ratios

拟合方程和速率常数见表3、表4。由表3、表4看出，拟合方程系数均在0.88以上，拟合度较好，符合指数模型。

2.1.3 活化能 由化学反应动力学可知，在皂角米多糖提取过程中，其速率常数k与温度T符合符合Arrhenius公式［29］:lnk=lnA－Ea/RT。用图1、表1中的数据作lnk与T关系图(见图5)，由图可知，lnk与T线性关系较好(R2=0.9892)。根据回归方程计算出皂角米多糖水提过程中的活化能Ea=1807×8.314=15.023 kJ/mol。

图4 不同提取条件下(C∞－C)/C∞与时间的关系Fig.4 The relationship between relative extraction rate and time under different extraction conditions

表3 不同温度下多糖相对萃余率对时间的回归结果Table 3 Regression results of polysaccharide relative raffinate ratio and time at different temperatures

2.1.4 半衰期 由t1/2对温度T作图，见图6。通过此公式可计算出提取一半皂角米多糖所需的时间。由图6可知，半衰期和温度曲线拟合较好(R2=0.9868)。半衰期反映了提取的效率，其数值与提取速率成反比，数值越小，提取速率越快。在一定温度范围内，半衰期与温度成反比。即提取温度升高，半衰期减小，升高温度有利于皂角米多糖提取。

表4 不同料液比下多糖相对萃余率对时间的回归结果Table 4 Regression results of polysaccharide relative raffinate ratio with time under different material－liquid ratios

图5 皂角米多糖lnk与1/T关系图Fig.5 Relationship between lnk and 1/T of polysaccharide from seeds of Gleditsia sinensis

图6 皂角米多糖t1/2与温度关系图Fig.6 Relationship between t1/2 and temperature of polysaccharide from seeds of Gleditsia sinensis

2.2 红外光谱分析

3422 cm－1出现的是O－H振动峰，峰形饱满，有分子内或分子间氢键存在［30］;2923 cm－1是C－H伸缩振动引起，是多糖的特征吸收峰［31］。1638 cm－1为糖环上C=O不对称收缩引起的振动峰，1384 cm－1为C－H弯曲振动峰;1010～1100 cm－1附近出现三个吸收峰(1151、1078、1027)为C－O伸缩振动峰，是吡喃糖苷的特征吸收峰，表明皂角米多糖中含有吡喃糖环［32］;871 cm－1为次甲基振动，表明含有β－型糖苷键［33］。808 cm－1处为甘露糖的特征吸收峰，524 cm－1处为羰基振动变形［34］。

2.3 皂角米多糖抗氧化活性研究

图7 皂角米多糖红外光谱图Fig.7 Infrared spectrum of polysaccharide from seeds of Gleditsia sinensis

2.3.1 皂角米多糖对ABTS阳离子自由基的清除能力 从图8可知，在浓度范围内，皂角米多糖对ABTS阳离子自由基的清除能力随浓度的升高而增大。荷叶离褶伞多糖也具有同样的清除作用，但清除能力不及皂角米多糖［35］。当浓度小于0.75 mg/mL，皂角米多糖和VC对ABTS阳离子自由基的清除能力相差不大;但当浓度大于0.75 mg/mL时，VC的清除能力明显高于皂角米多糖，并且皂角米多糖的清除能力随着浓度升高趋于变缓。当浓度为5 mg/mL时，皂角米多糖对ABTS阳离子自由基的清除率达71.82%，IC50为0.072 mg/mL。

图8 皂角米多糖对ABTS阳离子自由基的清除率Fig.8 ABTSfree radical scavenging rate of polysaccharides from seeds of Gleditsia sinensis

2.3.2 皂角米多糖对羟基自由基的清除能力 从图9可知，当浓度小于1 mg/mL时，皂角米多糖和VC对羟基自由基的清除率随浓度的升高快速增加;吴金松等［36］研究铁观音茶末多糖抗氧化活性实验中也表明了羟基自由基清除能力与多糖质量浓度有关。当浓度大于1 mg/mL时，皂角米多糖和VC对羟基自由基的清除率趋于稳定。在浓度范围内，VC对羟基自由基的清除率均大于皂角米多糖。当浓度为5 mg/mL时，皂角米多糖对羟基自由基清除率达83.36%，IC50为0.659 mg/mL。

2.3.3 皂角米多糖对DPPH自由基的清除能力 从图10可知，皂角米多糖和VC对DPPH自由基的清除能力随浓度的升高而增强，与余腾飞等［37］在研究忧遁草多糖对DPPH自由基清除能力的结论一致。在浓度范围内，VC对DPPH自由基的清除能力均大于皂角米多糖，但两者的清除率相差不大。当浓度为5 mg/mL时，皂角米多糖对DPPH自由基的清除率为84.00%，IC50为0.722 mg/mL。

图9 皂角米多糖对羟基自由基的清除率Fig.9 Scavenging rate of hydroxyl radicals by polysaccharides from seeds of Gleditsia sinensis

图10 皂角米多糖对DPPH自由基清除率Fig.10 DPPH free radical scavenging rate of polysaccharides from seeds of Gleditsia sinensis

2.3.4 皂角米多糖对超氧阴离子自由基的清除能力 从图11可知，在浓度范围内，随皂角米多糖浓度的升高，对超氧阴离子自由基的清除能力上升比较平缓，且呈现一定的量效关系。当浓度小于1 mg/mL，VC对超氧阴离子自由基清除率随浓度升高而显著增强，与陆海勤等［37］研究黄花菜多糖对超氧阴离子自由基清除能力的结论一致。当浓度大于1 mg/mL时，清除率趋于稳定。当浓度为5 mg/mL时，皂角米多糖对超氧阴离子自由基的清除率达86.11%，IC50为1.052 mg/mL。

图11 皂角米多糖对超氧阴离子自由基的清除率Fig.11 Scavenging rate of polysaccharides from seeds of Gleditsia sinensis to superoxide anion free radicals

3 结论

以Fick第一定律为基础，以皂角米为研究对象，用热水浸提的方式建立了皂角米多糖提取动力学模型，通过该模型可求得不同提取温度及不同料液比条件下的相关参数:表观速率常数k、相对萃余率(C∞－C)/C∞、半衰期t1/2、活化能Ea等。该模型计算值与实际测得数据吻合良好，计算结果表明，ln［C∞/(C∞－C)］与t线性关系较好，关系系数均大于0.9;活化能Ea为15.023 kJ/mol，在一定温度范围内，升高温度，有利于皂角米多糖的提取。通过红外光谱分析，皂角米多糖含有甘露糖，有吡喃糖环，为β型。皂角米多糖对ABTS阳离子自由基、羟基自由基、DPPH自由基、超氧阴离子自由基清除率分别为:71.82%、83.36%、84.00%、86.11%，表明皂角米多糖具有一定的抗氧化活性。