三裂叶豚草花粉新致敏蛋白组分超氧歧化酶克隆表达与致敏性

朱依雯，凌晓静，朱理想，魏继福

过敏性疾病的发病率在全球持续上升，而豚草花粉被认为是引起过敏性疾病的重要原因之一。目前已知约40种豚草花粉，最常见的是矮豚草和三裂叶豚草。我国自我上报的过敏性鼻炎患者中，豚草致敏率达23.5%，甘肃地区519例支气管哮喘患者中由豚草花粉引起者占11.75%(61/519)。目前国际免疫学会联合会(International Union of Immunological Societies，IUIS)数据库中豚草花粉过敏原主要来自矮豚草，而三裂叶豚草花粉报道较少。我国多地均有三裂叶豚草出现，对其致敏成分进行深入研究很有必要。

本研究旨在研究三裂叶豚草花粉新的致敏蛋白组分，为丰富三裂叶豚草过敏原组分的认识提供研究基础，并探讨其在中国人群中的致敏特征，进一步推动临床过敏性疾病的诊断和治疗。

1 材料与方法

1.1 材料

PCR试剂盒、TA克隆试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒、pET- 28a质粒载体限制性双切酶、异丙基硫代半乳糖苷IPTG等(大连宝生物工程有限公司)；重组克隆试剂盒(南京诺维赞生物科技有限公司)；Anti-IgE——辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)标记的羊抗人IgE(美国KPL公司)；四甲基联苯胺(tetramethyl benzidine，TMB)显色液(碧云天生物技术有限公司)；ELISA终止液(江苏凯基生物技术股份有限公司)；ECL显影液和PVDF膜(Merck公司)。

1.2 方法

1.2.1 三裂叶豚草花粉超氧歧化酶基因扩增与克隆：转录组测序由北京奥维森基因科技有限公司完成，将测序结果用基本局部比对算法搜索工具(basic local alignment search tool，BLAST)，与IUIS数据库已知的花粉序列进行比对，找到一个潜在的超氧歧化酶(superoxide dismutase，SOD)序列，并基于序列的非编码区设计引物，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。并进行PCR扩增、TA克隆，将TA克隆结果送至南京擎科生物科技有限公司进行测序，将测序正确的菌进行后续的重组克隆。

1.2.2 三裂叶豚草花粉超氧歧化酶序列比对：利用clustalX2序列比对工具将已报道蛋白类型属于超氧歧化酶的序列(http：//www.allergen.org/)与三裂叶豚草花粉超氧歧化酶进行多重序列比对，分析氨基酸序列之间的保守性。使用MEGA7通过邻接法(neighbor-joining法)构建系统进化树并分析其亲缘关系。

1.2.3 三裂叶豚草花粉超氧歧化酶表达和纯化：提取测序正确的重组质粒并转化到大肠杆菌BL- 21感受态细胞中，加入IPTG诱导蛋白表达，通过SDS-PAGE凝胶电泳验证成功诱导的菌株并进行大规模诱导培养。收集细菌并进行超声裂解，通过SDS-PAGE凝胶电泳确定蛋白表达形式。采用Ni柱亲和层析法对目的蛋白进行纯化，并利用梯度透析法得到去除尿素的复性蛋白并再次进行电泳验证。

1.2.4 酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)：将三裂叶豚草花粉超氧歧化酶重组蛋白稀释至10 μg/mL，包被到96孔板中4 ℃过夜，并使用1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)37 ℃封闭2 h。再加入1∶10稀释于PBS- 0.1% Tween 20的豚草过敏患者血清100 μL/孔，37 ℃孵育2 h。用PBS- 0.1% Tween 20洗板后加入Anti-IgE，37 ℃孵育1 h，洗板后用TMB显色液和ELISA终止液显色并终止，450 nm处测吸光度。检测结果使用GraphPad Prism 5作图，Cut-off值为阴性对照组吸光度平均值加上3倍标准偏差。

1.2.5 免疫印迹实验(Western blot)：10 μL纯化后的三裂叶豚草花粉超氧歧化酶经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭2 h，再加入1∶10稀释于PBS- 0.1% Tween 20 的ELISA阳性血清孵育过夜。PBS- 0.1% Tween 20洗涤后加入Anti-IgE，37 ℃下孵育1 h，最后用化学发光法检测结合在三裂叶豚草花粉超氧歧化酶上的IgE。

2 结果

2.1 三裂叶豚草花粉超氧歧化酶基因扩增与克隆

琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增产物大小在500个碱基附近(图1A)；对产物进行克隆和测序，三裂叶豚草花粉超氧歧化酶序列编码区含有465个碱基，编码154个氨基酸(图1B)。

图1 三裂叶豚草花粉超氧歧化酶序列信息

2.2 三裂叶豚草花粉超氧歧化酶序列比对与进化树分析

根据clustalX2多重序列比对，三裂叶豚草花粉超氧歧化酶与橄榄花粉超氧歧化酶Ole e 5的氨基酸序列一致性最高，达53.9%(图2A)。对三裂叶豚草花粉超氧歧化酶与其他来源的超氧歧化酶进行系统进化树分析，三裂叶豚草花粉超氧歧化酶与橄榄花粉Ole e 5聚为一簇，自展值为100(图2B)。

图2 三裂叶豚草花粉超氧歧化酶与其他物种同源过敏原多重序列比对与进化树

2.3 三裂叶豚草花粉超氧歧化酶表达和纯化

三裂叶豚草花粉超氧歧化酶蛋白以包涵体形式在相对分子质量16 000附近表达(图3箭头所示)。利用重组蛋白C-末端的组氨酸标记，在变性条件下采用Ni柱亲和层析法对目的蛋白进行纯化，并电泳验证发现纯化效果较好(图3)。

图3 三裂叶豚草花粉超氧歧化酶表达纯化

2.4 酶联免疫吸附实验与免疫印迹实验

通过ELISA验证三裂叶豚草花粉超氧歧化酶与豚草过敏患者血清中IgE结合活性，在42个豚草花粉过敏患者血清中有5个吸光度值大于Cut-off值，IgE结合率为12%(5/42)(图4A)。利用免疫印迹实验对其IgE结合活性进一步验证，发现5个ELISA阳性患者血清均在免疫印迹中显示出阳性结合条带(图4B)。

图4 三裂叶豚草花粉超氧歧化酶免疫原性

3 讨论

本研究通过转录组学测序和蛋白组学研究，在三裂叶豚草花粉中发现一种新致敏蛋白组分超氧歧化酶。通过基因扩增、分子克隆和表达纯化，获得超氧歧化酶重组蛋白。最后通过ELISA和Western blot验证该重组蛋白的免疫原性，其IgE结合率为12%(5/42)。

超氧歧化酶在生物系统中起着重要的作用，催化超氧化物(O)自由基的歧化生成HO和O。超氧歧化酶也是一种重要的致敏蛋白组分，Boluda等发现橄榄花粉中的超氧歧化酶是引起过敏性呼吸道疾病的重要原因，Crameri证明超氧歧化酶与烟曲霉相关肺部并发症的发生具有一定的关联，Wagner等利用大肠杆菌表达系统确认乳胶中的超氧歧化酶是一种重要的泛过敏原，瑞典学者也证实马拉色菌中的超氧歧化酶与诱导特应性湿疹/皮炎综合征有关，伊朗学者在开心果中鉴定到一种重要的坚果致敏蛋白组分即超氧歧化酶，超氧歧化酶作为致敏蛋白组分在链格孢中也被发现。

IUIS数据库中有多种类型的超氧歧化酶，它们之间的IgE结合率各有不同，如吸入性过敏原橄榄Ole e 5为35%(7/20)、接触性过敏原皮肤真菌Mala s 11为75%(21/28)、食物性过敏原开心果Pis v 4为40%(10/25)等。多重序列比对发现三裂叶豚草花粉超氧歧化酶与橄榄Ole e 5氨基酸序列存在一定的保守性，但并不高。虽然系统进化树显示两者亲缘关系较近，但草本植物与木本植物物种间的跨度、氨基酸序列差异及地域差异最终表现为两者IgE结合率的不同。另外，5份ELISA阳性血清在进一步的Western blot验证下均显示出阳性结合条带，可能的原因是，不管构象表位在空间结构中是否遭到破坏，线性表位仍然贡献了主要的IgE结合能力，但其空间结构的特性仍需要探索。

三裂叶豚草花粉超氧歧化酶被证实是一种新的致敏蛋白组分，为三裂叶豚草花粉过敏患者的过敏原特异性免疫治疗提供了信息并奠定了基础，对临床过敏性疾病的诊断和治疗具有重要意义。