对破壁处理灵芝孢子粉功能特性的测定与分析

刘俊丽，崔清亮，张玉蕾，来思彤

（山西农业大学 工学院，山西太谷 030801）

0 引言

灵芝孢子是灵芝的生殖细胞，它含有多糖、总三萜、脂肪酸等多种对人体有益的功能性成分［1］，其中多糖、三萜是其特有的生物活性物质，具有抗肿瘤、抗癌及抗氧化等功效［2-4］，其含有的蛋白质又富含人体所需的真菌免疫调节蛋白、糖蛋白、凝集素及酶等［5］。有研究表明，灵芝孢子粉孢壁坚硬，功能性物质被包裹在孢壁内，很难被释放出来［6］，直接食用未破壁的灵芝孢子粉，不易被人体消化吸收。

目前，对灵芝孢子粉的研究大多局限于某一种成分，黄晓兰等［7］比较了破壁前后灵芝孢子粉的多糖溶出量，杨晓英等［8］比较了破壁前后灵芝孢子粉的总三萜溶出量。本文采用球磨法对灵芝孢子粉进行破壁处理，测定并分析破壁前后灵芝孢子粉基本营养成分、粗多糖和总三萜的溶出量，及其水、醇提取物的抗氧化性。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

材料：灵芝孢子粉由山西农业大学食用菌中心提供。

试剂：葡萄糖（标准品，天津市致远化学试剂有限公司）；苯酚（分析纯，天津市北辰方正试剂厂）；熊果酸（标准品，合肥博美生物科技有限责任公司）；香草醛（分析纯，北京索莱宝科技有限公司）；冰乙酸、乙酸乙酯和高氯酸（均为分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

TissueLyser Ⅱ球磨仪（德国凯杰生物技术（上海）有限公司）；CMM-15E型透反射金相显微镜（上海长方光学仪器有限公司）；721N可见分光光度计（上海双旭电子有限公司）；25×16型血球计数板（海门市春博生物实验器材厂）。

2 试验设计方法

2.1 灵芝孢子粉破壁率标准曲线绘制

称量0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 g未破壁灵芝孢子粉，溶解并定容于50 mL容量瓶中。用血球计数板依次对已经配制好的悬浊液进行计数。以灵芝孢子粉称样量为横坐标，以对应的每个计数单位孢子的平均数为纵坐标，绘制标准曲线［9］，得到标准曲线回归方程为：

式中 y1——每个计数单位的孢子数，个；

x1——未破壁灵芝孢子粉称样量，g。

灵芝孢子粉破壁率以质量分数（%）表示，结果按下式计算。

式中 N1—— 从标准曲线查到的与待测样品相同质量的未破壁孢子粉的个数；

N2—— 计数得到的破壁孢子粉样品中未破壁的孢子粉的个数。

2.2 灵芝孢子粉基本营养成分测定

水分按照GB/T 5009.3-2016《食品中水分的测定》进行测定［10］；粗蛋白的测定按照国标GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》的凯氏定氮法测定［11］，取样量为0.50 g；粗脂肪测定按照国标GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的测定》测定［12］，取样量为1.00 g；灰分含量的测定按照国标GB 5009.4-2016《食品中灰分的测定》测定［13］，取样量为1.00 g。

2.3 灵芝孢子粉活性物质溶出量测定

2.3.1 粗多糖溶出量测定

粗多糖溶出量的测定参照樊伟伟等［14］的方法。

（1）标准曲线绘制。吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 0.1 mg/mL葡萄糖溶液，分别用蒸馏水补足到1.0 mL。加入1 mL 5%苯酚溶液、5 mL浓硫酸，静置10 min后使用涡旋振荡器混匀，30 ℃水浴保温20 min。在490 nm处比色，测定其吸光值。绘制标准曲线，得到葡萄糖质量与吸光值的回归方程为：

式中 y2——葡萄糖质量，mg；

x2——葡萄糖对应的吸光值。

（2）粗多糖待测液制备。称取破壁前后灵芝孢子粉0.25 g于15 mL离心管，加入2.5 mL蒸馏水，并缓慢注入10 mL无水乙醇，使用涡旋振荡器充分混匀后，超声提取30 min，4000 r/min条件下离心10 min，弃去上清。将不溶物中加入10 mL 80%乙醇进行洗涤，离心后弃去上清液，使用25 mL蒸馏水将沉淀转入50 mL刻度试管，沸水浴提取2 h。待冷却至室温后，过滤，将滤液转至50 mL容量瓶。将残渣洗涤3次，合并洗涤液，加水定容至50 mL。测定时取1 mL待测液，后续步骤同标准曲线。样品中的粗多糖溶出量以（g/100g）表示，结果下式计算。

式中 m1—— 从标准曲线上查得样品测定液中含葡萄糖量，μg；

V1——样品定容体积，mL；

V2—— 比色测定时所移取样品测定液的体积，mL；

m2——样品质量，g；

0.9 ——葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。

2.3.2 总三萜溶出量的测定

总三萜溶出量的测定参照徐雪峰等［15］的方法。

（1）标准曲线绘制。吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 0.1 mg/mL熊果酸对照品溶液，分别于100 ℃水浴蒸干，加入4 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1 mL高氯酸，65 ℃水浴加热45 min，转入冰浴后加入5 mL冰乙酸，摇匀后置于室温。15 min后于548 nm处比色，测定其吸光值。绘制标准曲线，得到熊果酸质量与吸光值的回归方程为：

式中 y3——熊果酸质量，mg；

x3——熊果酸对应的吸光值。

（2）总三萜待测液制备。准确称取破壁前后灵芝孢子粉0.50 g，加入15 mL乙酸乙酯溶解，超声提取30 min后过滤，弃去初滤液，续滤液用乙酸乙酯定容于50 mL容量瓶。测定时取1 mL待测液，水浴蒸干后加试剂同标准曲线。样品中的总三萜溶出量以（g/100g）表示，结果下式计算。

式中 m1—— 从标准曲线上查得样品测定液中含熊果酸量，μg；

V1——样品定容体积，mL；

V2—— 比色测定时所移取样品测定液的体积，mL；

m2——样品质量，g。

2.4 灵芝孢子粉水、醇提取物抗氧化性的测定

取1.0 g灵芝孢子粉，按1：10体积分别加入10 mL的蒸馏水和70%乙醇，60 ℃超声提取30 min，4 000 r/min离心15 min，取上清液分别进行水、醇提取物抗氧化性测定［16-17］。

2.4.1 清除DPPH·能力的测定

分别取灵芝孢子粉水、醇提取物0.2 mL，加入3.8 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，振荡混匀，避光静置30 min，于517 nm波长处测定吸光值A1。同时，用无水乙醇代替DPPH溶液，测得吸光值A2，并测定3.8 mL DPPH溶液和0.2 mL 70%乙醇的吸光值A0。灵芝孢子粉水、醇提取物DPPH·清除率以（%）表示，结果按下式计算。

2.4.2 清除ABTS能力的测定

分别取灵芝孢子粉水、醇提取物0.1 mL，加入3.9 mL ABTS（于734 nm测得吸光值为0.7），振荡混匀，避光静置15 min，于734 nm波长处测定吸光值A'0。灵芝孢子粉水、醇提取物ABTS·清除率以（%）表示，结果按下式计算。

2.4.3 还原能力的测定

吸取0、0.025、0.05、0.1、0.15、0.2 mL 1 mmol/mL FeSO4标准溶液，加蒸馏水补至0.2 mL，加4 mL TPTZ，振荡混匀，37 ℃水浴反应10 min，于593 nm波长处测定吸光值A。绘制标准曲线，得到FeSO4浓度与吸光值的回归方程为：

式中 y4——FeSO4浓度，μmoL/g；

x4——FeSO4对应的吸光值。

分别取灵芝孢子粉水、醇提取物0.2 mL，加入4 mL TPTZ，振荡混匀，37 ℃水浴反应10 min，于593 nm波长处测定吸光值A'。从FeSO4标准曲线查得样品相应的FeSO4浓度（μmol/mL），根据取样量将单位转化为μmol/g得FRAP值。

3 结果与分析

3.1 灵芝孢子粉破壁率测定分析

采用球磨仪对灵芝孢子粉进行破壁处理，于400倍显微镜下观察并计数，计算得灵芝孢子粉破壁率为91.66%。显微镜下可看到大部分灵芝孢子粉孢壁破裂，视野下分布大小不均一的碎片。

3.2 灵芝孢子粉基本营养成分分析

灵芝孢子粉破壁前后基本营养成分测定结果见表1。破壁前后灵芝孢子粉水分均为0.03%，灰分分别为1.84%和1.99%，水分和灰分在破壁前后均无显著变化。破壁前后灵芝孢子粉粗蛋白溶出量分别为5.57%和7.46%，破壁后溶出量提高了33.90%。敖宏［18］的研究表明，灵芝蛋白粗提物清除活性随着灵芝蛋白浓度的增加而逐渐增强。破壁后灵芝孢子粉中的粗蛋白溶出量增加，其具有的抗氧化作用也随之增加。

表1 灵芝孢子粉破壁前后基本营养成分测定结果 %

灵芝孢子粉粗脂肪溶出量是评价灵芝孢子粉质量较为重要的一个指标，粗脂肪溶出量的高低代表着灵芝孢子粉质量的好坏。由表1可知：破壁前后灵芝孢子粉粗脂肪溶出量分别为7.55%和22.17%，破壁后溶出量提高了2.94倍。与其他基本营养成分相比，破壁灵芝孢子粉粗脂肪溶出量增加最为显著。破壁灵芝孢子粉粗脂肪溶出量显著提高的缘由是孢子内部甘油三酯被大量释放，可增加人体吸收孢子粉营养成分的可能性［19］。

3.3 灵芝孢子粉活性物质测定结果分析

灵芝孢子粉破壁前后活性物质溶出量见表2。破壁前后灵芝孢子粉粗多糖溶出量分别为0.88，1.24 g/100g，破壁后提高了40.90%，提高了人体对粗多糖吸收利用的可能性。赵晓燕等［20］的试验结果表明，99%破壁率灵芝孢子粉较未破壁灵芝孢子粉粗多糖溶出量有所提高。曹龙奎等［21］通过激光粒度测定仪测得经行星球磨仪破壁的玉米花粉颗粒直径从原来的80～100 μm降至8 μm以下，破壁后玉米花粉中的活性成分进一步释放。这与本试验中采用球磨仪对灵芝孢子粉进行破壁处理的效果一致。

表2 灵芝孢子粉破壁前后活性物质溶出量测定结果

破壁前后灵芝孢子粉总三萜溶出量分别为1.63，2.53 g/100g，破壁后提高了55.21 %。赵晓燕等［20］采用超微粉碎处理得到99%破壁率的灵芝孢子粉，其总三萜溶出量提高了77%。灵芝孢子粉受到球磨仪中的剪切和压缩联合外力作用致孢壁破裂，孢内灵芝孢子粉总三萜溶出量提高。

3.4 灵芝孢子粉抗氧化性测定结果分析

灵芝孢子粉破壁前后DPPH·清除率试验结果如图1（a）所示。破壁前灵芝孢子粉水提取物的DPPH·清除率仅为13.74%，但在破壁后为68.52%，提高了4.99倍；破壁前醇提取物的DPPH·清除率为42.33%，破壁后为67.33%，提高了59.04%。破壁前灵芝孢子粉醇提取物比水提取物的DPPH·清除率提高了3.08倍，但在破壁后水、醇提取物对DPPH·的清除能力分别为68.52%、67.33%，表明破壁前灵芝孢子粉水、醇提取物对DPPH·的清除能力相差较大，而在破壁后对DPPH·的清除能力相对持平。这与灵芝孢子粉粗多糖和总三萜的溶出量相关［22］。灵芝孢子粉水提取物抗氧化能力在一定程度上可反映粗多糖抗氧化能力，而醇提取物抗氧化能力在一定程度上可反映总三萜的抗氧化能力。未破壁灵芝孢子粉中总三萜高于粗多糖，使得未破壁灵芝孢子粉醇提取物比水提取物的DPPH·清除率高。

灵芝孢子粉破壁前后ABTS·清除率试验结果如图1（b）所示。破壁前灵芝孢子粉水提取物的ABTS·清除率为27.52%，但在破壁后为33.58%，提高了22.05%；破壁前醇提取物的ABTS·清除率为31.57%，破壁后为35.59%，提高了12.76%。破壁前灵芝孢子粉醇提取物比水提取物的ABTS·清除率提高14.72%；破壁后灵芝孢子粉的水、醇提取物对ABTS·的清除能力33.58%、35.59%，表明破壁后灵芝孢子粉水、醇提取物的对ABTS·清除能力相对持平。

灵芝孢子粉破壁前后还原能力试验结果如图1（c）所示。未破壁灵芝孢子粉水提取物的FRAP值为11 955 μmol/g，破壁后为27 041 μmol/g，提高了2.26倍；未破壁灵芝孢子粉醇提取物的FRAP值为23 348 μmol/g，破壁后为31 938 μmol/g，提高了36.79%。破壁前灵芝孢子粉醇提取物比水提取物的还原能力提高了1.95倍，而在破壁后醇提取物比水提取物的还原能力仅提高了18.11%，表明破壁前灵芝孢子粉水、醇提取物的还原能力相差较大，而在破壁后还原能力相差较小。灵芝三萜和多糖抗氧化性研究表明，抗氧化能力与活性物质溶出量成正相关［23］。破壁后灵芝孢子粉多糖和总三萜溶出量分别提高了40.90%和55.21%，抗氧化能力提高。

破壁后灵芝孢子粉水、醇提取物对DPPH·、ABTS·清除率及还原能力大小顺序均为DPPH·＞FRAP＞ABTS·；破壁前灵芝孢子粉醇提取物对DPPH·、ABTS·清除率及还原能力大小顺序为DPPH·＞FRAP＞ABTS·，破壁后灵芝孢子粉水、醇提取物对三者的抗氧化能力相差较小。

4 结语

破壁前后灵芝孢子粉的水分和灰分变化不显著，粗蛋白和粗脂肪溶出量明显增加，尤其是粗脂肪溶出量比未破壁灵芝孢子粉提高了2.94倍；破壁前后灵芝孢子粉粗多糖、总三萜的活性物质溶出量均显著提高；破壁后灵芝孢子粉的水、醇提取物的抗氧化能力均优于未破壁灵芝孢子粉。