不同贮藏温度下阿根廷鱿鱼内源性甲醛及相关物质的变化规律

宋素珍，李佳琳，曹娜娜，赵梦晓，杨贤庆，沈 琳，李颖畅

（1.渤海大学 食品科学与工程学院，辽宁锦州 121013；2.中国水产科学研究院南海水产研究所，广州 540641；3.大连东霖食品股份有限公司，辽宁大连 116101）

0 引言

阿根廷鱿鱼具有很高的营养价值，属于低脂肪高蛋白海产品，是我国最重要的经济类海产品之一。近年来鱿鱼等海产品内含有甲醛的问题一直受到国内外的广泛关注。研究证明鱿鱼及其制品中含有较高含量的甲醛（FA）［1-3］。FA能够与细胞亲核物质发生反应，导致DNA损伤，进而引发各种癌症；甲醛还可与氨基酸残基反应，促进蛋白质链分子间和分子内连接形成共价交联，从而使蛋白质变性，影响鱿鱼的品质［4］。鱿鱼内源性甲醛的产生途径包括：生物途径和非酶途径［5］。在低温贮藏期间，酶学途径是水产品产生内源性甲醛的主要途径［6］。国外研究者对鳕鱼等海产品中的氧化三甲胺脱甲基酶（TMAOase）进行初步研究，TMAOase主要集中在内脏组织［7-8］。

低温保鲜是水产品保鲜中最为常见的一种方法［9］，但是低温贮藏过程中仍会有甲醛产生。Jinhwan等［10］研究了贮藏条件对鳕鱼甲醛含量的变化；韩冬娇等［11］研究了不同贮藏温度下南白美对虾中甲醛的含量；苗林林等［12］研究了梭子蟹贮藏和加工过程中内源性甲醛含量的变化，但是不同贮藏温度下，鱿鱼中甲醛变化规律以及与氧化三甲胺脱甲基酶（TMAOase）活性的关系研究鲜见报道。

本文通过测定不同贮藏温度下阿根廷鱿鱼体内FA、DMA、TMA、TMAO、TMAOase活性、肌原纤维蛋白溶解性、菌落总数，探讨了不同温度对阿根廷鱿鱼中甲醛的影响及酶催化途径对鱿鱼甲醛的积累作用，旨在为酶学途径控制海产品中甲醛含量提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阿根廷鱿鱼（锦州市林西路水产市场）；曲拉通X-100（TritonX-100，北京化学试剂公司）；甲醛溶液（分析纯，辽宁泉瑞试剂有限公司）；甲苯（分析纯，上海易恩化学技术有限公司）；甲醇（色谱纯，DIKMA公司）；苦味酸（分析纯，西陇化工股份有限公司）；甲醛标准溶液（10.4 mg/mL，国家环境保护总局标准样品研究所）；三羟甲基氨基甲烷（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；TMAO标准品（国家环境保护总局标准样品研究所）。

1.2 仪器与设备

UV-2550紫外-可见分光光度仪（岛津仪器有限公司）；THERMO X1R冷冻高速离心机（美国Thermo公司）；Agilent GC7890气相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；MS105DU电子分析天平（METTLER TOLEDO公司）；雷磁pHS-C型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 贮藏条件

将阿根廷鱿鱼分别在4 ℃，0 ℃，-20 ℃下贮藏，测定样品FA、DMA、TMA、TMAO、TMAOase酶活、肌原纤维蛋白溶解度、菌落总数，根据不同温度的贮藏期，4 ℃和0 ℃贮藏18 d，每隔2 d取样测定，-20 ℃下分别在0、9、18、27、36、45、54 d取样测定。各指标测定均做三个重复试验，每个试验平行测定两次。

1.3.2 样品处理

根据朱军莉等［13］的方法略作修改，将阿根廷鱿鱼清洗、去皮、取胴体，取2.00 g绞碎的鱼肉，加50 mL超纯水，震荡混匀后浸泡10 min，加入20 mL 10%三氯乙酸混匀，冰浴超声30 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液，用1 mol/L NaOH调至pH 4.0，然后定容至100 mL，4 ℃冷藏待用。

1.3.3 甲醛（FA）的测定

根据Benjakul等［14］的方法测定FA含量，取1 mL上清液，加蒸馏水至5mL，加入乙酰丙酮溶液1 mL，混合均匀，60 ℃水浴10 min，取出冷却，以空白为参比，于波长413 nm处测吸光度值。公式如下：

式中 A ——样品管相当于标准甲醛的量，μg；

m ——样品质量；

v1——TCA萃取总体积；

v2——样品测定萃取体积；

X ——甲醛的含量，mg/kg。

1.3.4 二甲胺的测定

根据贾佳［15］等的方法测定二甲胺（DMA）含量，取2 mL上清液，加入2 mL 65%KOH溶液，定容至5 mL，加入2 mL对甲苯磺酰氯-甲苯溶液，60 ℃水浴加热1 h，取出冰浴冷却，漩涡振荡3 min，进行GC-FID分析。

1.3.5 三甲胺的测定

根据贾佳的方法略作修改，取4mL上清液，依次加入l mL 10% FA、5 mL甲苯、3 mL 25% KOH，30 ℃水浴30 min，震荡3min，将甲苯层用0.2 g无水硫酸钠吸水，吸取2 mL无水甲苯层与2 mL苦味酸混合，以空白为参比，在410 nm处测定吸光值。

1.3.6 氧化三甲胺的测定

取4 mL反应液加入1%三氯化钛溶液0.50 mL，振荡混匀于80 ℃水浴90 s，冷水冷却。其他步骤同TMA测定步骤相同。氧化三甲胺（TMAO）计算公式如下：

式中 A0——样品中氧化三甲胺的含量，mg/kg；

A1—— 经三氯化钛溶液还原后的三甲胺含量，mg/kg；

A2——样品中三甲胺的含量，mg/kg；

79.11 ——氧化三甲胺的相对分子质量；

59.11——三甲胺的相对分子质量。

1.3.7 氧化三甲胺脱甲基酶活性的测定

参考金洋等［16］的方法提取粗酶，称取15 g肝脏，以l：3的比例加入抽提液（0.1 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-乙酸），混合匀浆100 s，离心（10 000 r/min，4 ℃，30 min）除去杂蛋白，用1 mol/L HCl将其酸化，调节pH至4.5后，离心（4 ℃，10 000 r/min，30 min），除去杂蛋白；再用1 mol/L NaOH调节pH至6.0，继续离心（4 ℃，10 000 r/min，30 min），取上清液，即为酸化的粗酶液。

参考Kimura等［17］的方法测定氧化三甲胺脱甲基酶活性。反应液中含有20 mmol/L TMAO、2 mmol/L半胱氨酸、2 mmol/L抗坏血酸、0.2 mmol/L FeCl2和20 mmol/L Tris-乙酸（pH 7.0），加入酶液，25 ℃反应15 min后加入10% TCA 终止反应，离心（4 ℃，8 000 r/min，15 min），取1 mL上清液测定甲醛含量。在相同条件下，分别以不加酶液的反应液和不加反应液的酶液作为阴性对照。

1.3.8 肌原纤维蛋白溶液的提取

参考Bertram［18］方法略作修改，将阿根廷鱿鱼流水解冻，去皮，取酮体肉，加3倍体积A液（0.1 mol/L KCl、0.02 mol/L Tris-HCl，pH 7.5）和1倍体积B液（1% Triton X-100、0.1 mol/L KCl、0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 7.5）均质（10 000 r/min，30 s，至少6次），纱布过滤（除去结缔组织），离心（4 ℃，10 000 r/min，10 min），去上清液，沉淀用4倍体积A液浸提，重复浸提4次，所得沉淀即为肌原纤维蛋白，并测定其蛋白质含量。所有操作均在4 ℃条件下进行，备用。

1.3.9 肌原纤维蛋白溶解度的测定

参考Benjakul［19］的方法略作改进，取5 mL蛋白浓度为5 mg/mL的肌原纤维蛋白溶液于7 mL离心管中，离心（4℃，3 000 r/min，10 min），立即取上清液1 mL，并加入4 mL双缩脲试剂混匀，在25 ℃中静置30 min，以空白为参比，540 nm下测吸光度，重复3次，肌原纤维蛋白的溶解程度用溶解性（PS）来表示，公式如下：

式中 C1——离心后上清液中的蛋白质浓度；

C2——离心前的蛋白质浓度。

1.3.10 菌落总数的测定

参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》的方法测定［20］。

1.4 数据分析

每个试验7次重复3次，用SPASS19.0对进行方差分析，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏温度下FA含量的变化

图1是阿根廷鱿鱼在4 ℃，0 ℃和-20 ℃贮藏过程中FA含量的变化。结果显示，4 ℃，0 ℃和-20 ℃鱿鱼的FA初始值为6.68 mg/kg，随着贮藏时间的增加FA含量显著增加（P＜0.05），到贮藏末期其含量分别达到了16.54、13.48和12.69 mg/kg。

在低温贮藏过程中甲醛的产生主要是由于鱿鱼体内氧化三甲胺脱甲基酶的催化作用。4 ℃和0 ℃贮藏后期迅速增加可能是由于鱿鱼组织受到鱿鱼内部器官的污染，使肌肉组织充分与氧化三甲胺酶接触导致甲醛增加；在-20 ℃的冷冻贮藏状态下，氧化三甲胺脱甲基酶仍有活性，导致FA含量增加；相同贮藏时间内，4 ℃甲醛含量最高，然后是0 ℃，-20 ℃最低，各温度之间差异显著（P＜0.05），这可能是由于4 ℃条件下酶的活性较强，同时还有微生物的腐败作用；贮藏温度越低，甲醛含量就越低，因此低温贮藏有利于控制鱿鱼中的甲醛含量。朱仁义等［21］对室温0 ℃，4 ℃和-20 ℃贮藏条件下的乌贼内源性甲醛含量进行研究，发现了相似的变化。

2.2 不同贮藏温度下DMA含量的变化

二甲胺是海产品氧化三甲胺分解产物之一，是鱼肉的腐败指标之一，也是鱼肉腥臭味的来源。研究表明，氧化三甲胺在氧化三甲胺脱甲基酶的作用下分解为甲醛和二甲胺［22-23］。图2是阿根廷鱿鱼在4 ℃，0 ℃和-20 ℃贮藏过程中DMA含量的变化。结果显示，4 ℃，0 ℃和-20 ℃鱿鱼的DMA初始值在100 mg/kg左右。随着贮藏时间的增加，DMA含量显著增加（P＜0.05），且与贮藏时间显著相关（R4℃=0.981，R0℃=0.996，R-20℃=0.990），各温度之间DMA含量差异显著。到贮藏末期4 ℃，0 ℃和-20 ℃贮藏条件下DMA含量分别达到初期的3.6倍、3.4倍和2.1倍，相同贮藏时间内，4 ℃DMA含量最高，然后是0 ℃，-20 ℃最低，温度低时酶活性部分被抑制，二甲胺含量相对较低。

2.3 不同贮藏温度下TMA含量的变化

三甲胺是氧化三甲胺的还原产物，具有腥臭味，因此也可用来判断水产品是否新鲜。鳕鱼等深海鱼类体内含有氧化三甲胺，当鱼类死后，在微生物和酶的作用下，氧化三甲胺被还原为三甲胺，随着鱼体新鲜度的下降，三甲胺含量逐渐增加［24］。图3是阿根廷鱿鱼在4 ℃，0 ℃和-20 ℃贮藏过程中TMA含量的变化。结果显示，4 ℃和0 ℃鱿鱼的TMA初始值为35.29 mg/kg，随着贮藏时间的增加TMA含量显著增加（P＜0.05），到贮藏末期其含量分别达到了270.58和218.3 mg/kg，在冷藏初期，鱿鱼新鲜，品质良好，TMA含量低，到冷藏后期鱿鱼开始腐败，TMAO在酶和微生物作用下，鱼腥味产生，TMA含量增加；-20 ℃下TMA由初始的35.29 mg/kg增长到190.2 mg/kg，由于低温鱼体内代谢缓慢，因此三甲胺增长缓慢；相同贮藏时间内，4 ℃甲醛含量最高，然后是0 ℃，-20 ℃最低。

2.4 不同贮藏温度下TMAO含量的变化

TMAO是海洋生物中的天然渗透剂和重要的非蛋白氮、水产品的鲜味物质，也是产生三甲胺（TMA）、二甲胺（DMA）和甲醛（FA）的主要前体物质［25］。图4是阿根廷鱿鱼在4 ℃，0 ℃和-20 ℃贮藏过程中TMAO含量的变化。结果显示，4，0 ℃和-20 ℃贮藏下TMAO含量均呈现下降趋势，不同温度下贮藏时间对TMAO含量变化的影响差异显著（P＜0.05）；相同贮藏时间内，4 ℃氧化三甲胺含量最低，0 ℃次之，-20 ℃最高，可见温度越低氧化三甲胺分解越慢。

2.5 不同温度贮藏下TMAOase活性的变化

TMAOase广泛分布于海产动物组织中，是海产品中TMAO产生内源性甲醛的主要酶类［26］。图5是在4，0，和-20 ℃贮藏下阿根廷鱿鱼肝脏中TMAOase活性的变化，结果显示，4，0和-20 ℃贮藏下鱿鱼的TMAOase的初始活性在1.38 U/g；4和0 ℃贮藏条件下，氧化三甲胺脱甲基酶活性显著（P＜0.05）升高，后趋于平缓，这可能是由于贮藏时间的延长TMAOase发生变性从而导致酶活性降低；-20 ℃时随着贮藏时间的延长呈现先升高（P＜0.05）后降低的趋势（P＜0.05），这可能是由于TMAOase主要集中在溶酶体膜上［27］，-20 ℃贮藏后期由于冰晶变大导致溶酶体膜被破坏，从而导致TMAOase的活性降低。

2.6 不同贮藏温度下肌原纤维蛋白溶解度的变化

溶解性是反映蛋白变性的一个重要指标，反映鱿鱼产品的品质［28］。图6是阿根廷鱿鱼在4 ℃，0 ℃和-20 ℃贮藏过程中肌原纤维蛋白溶解性变化。结果显示，3组蛋白的初始溶解度为72.9%，随着贮藏时间的延长，各温度下蛋白的溶解性呈下降趋势，3组贮藏条件分别在第18、54 d时溶解性分别达到50.01%、53.17%、54.62%；相同贮藏时间内4 ℃下降最多，依次是0，-20 ℃，各温度之间存在显著差异（P＜0.05），温度越低，蛋白变性越慢，溶解性越好；这和甲醛的生成量相关，FA与蛋白质侧链的官能团发生反应，形成分子内和分子间的亚甲基桥，使蛋白质变性，蛋白质二级结构伸展，发生聚集，聚集物增加，导致了蛋白质溶解度的下降。

2.7 不同贮藏温度下鱿鱼菌落总数的变化

海产品在贮藏过程中极易受到微生物感染，菌落总数可反映海产品的腐败程度，同时鱿鱼等海产品在微生物的作用下也可产生少量甲醛［29］。图7是阿根廷鱿鱼在4 ℃，0 ℃和-20 ℃贮藏过程中菌落总数的变化。结果显示，贮藏初期阿根廷鱿鱼的菌落总数均小于4 lg（CFU/g），均处于1级鲜度。随着贮藏时间的增加，各温度下的菌落总数总体呈上升趋势；4 ℃，0 ℃贮藏至15 d分别达到6.4、6.03 lg（CFU/g），鱿鱼已经超过了食用价值。相同贮藏时间内，-20 ℃的菌落总数低于4 ℃，0 ℃。菌落总数与FA、DMA、TMA变化趋势一致，主要是由于微生物能利用TMAO，产生TMA，菌落总数的增加导致鱼肉组织迅速软化和水解，加速了鱼肉腐败，而这一过程又促进了鱿鱼组织中的TMAOase释放与激活，使鱼肉组织中的DMA和FA含量迅速增加［30］。

3 结语

阿根廷鱿鱼在4 ℃、0 ℃和-20 ℃贮藏下，随贮藏时间的延长菌落总数、甲醛、二甲胺、三甲胺显著性增加（P＜0.05），氧化三甲胺、溶解度显著性降低（P＜0.05）；4 ℃和0 ℃下酶活先升高后平缓；-20 ℃下酶活先升高后下降。低温贮藏过程中，温度越低，甲醛含量越低；各温度下TMAOase活性与甲醛含量显著相关；因此，低温贮藏过程中酶学途径是产生甲醛的主要途径，通过控制酶的活性来控制鱿鱼甲醛的产生至关重要。