绿咖啡豆绿原酸的体外抗氧化性活性测定

曹卓松，孙飞龙，唐 薇，宁景叶

（西安工程大学 环境与化学工程学院，西安 710600）

0 引言

绿原酸（Chlorogenic acid，CGA）来源于天然植物，成分安全，广泛应用于医疗保健、日用化工以及食品制造等行业，近年来国内外学者对CGA的结构、成分、性质、提取纯化工艺及其生物活性等方面进行了大量研究。Rodrigues研究发现咖啡中基因型是影响生咖啡豆中生物活性物质含量和抗氧化能力的决定因素，并且发现咖啡中清除活性氧和活性氮的活性物质主要是CGA［1］。

体外抗氧化性测定方式有很多，比如还原能力（即Fe3+还原能力）和抑制自由基能力（即DPPH自由基清除能力）等。梁萱等人研究了桃花中CGA的还原力和抗氧化活性，并以Vc和CGA标准品做对照，用K3［Fe（CN）6］测还原力，采用DPPH自由基清除法、D-脱氧核糖-铁体系法和邻苯三酚自氧化法测其抗氧化活性，证明了桃花提取物中主要活性物质是CGA［2］。

本文利用铁离子还原法和DPPH自由基清除法测定绿咖啡豆绿原酸（Green Coffee Bean Chlorogenic acid，GCBCGA）的体外抗氧化活性，并探究了温度、光照、pH值对GCBCGA稳定性（抗氧化活性）的影响，本课题对GCBCGA作为天然抗氧化剂的研究发展提供了一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

将经过纯化、浓缩、干燥后得到的GCBCGA粉末用无菌水溶解，即得不同浓度的GCBCGA样品液，下述为GCBCGA样液。

TPTZ，DPPH，冰醋酸，山梨酸钾，结晶乙酸钠，七水合硫酸亚铁，柠檬酸，三氯化铁，抗坏血酸，无水亚硫酸钠，30%过氧化氢均为分析纯；蒸馏水为试验室自制。

1.2 仪器

DJ灵巧型粉碎机（上海淀久中药机械有限公司）；AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；SHH· W21· 420型三用电热恒温水箱（余姚市东方电工仪器厂）；752N型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；酸度计（上海任氏电子有限公司）。

1.3 抗氧化性的测定

1.3.1 FRAP还原力的测定

（1）FeSO4标准曲线的绘制。FRAP溶液的配制：称取0.31 g结晶乙酸钠溶解至1.6 mL冰醋酸中，用蒸馏水定容至100 mL，得到300 mmol/L的醋酸缓冲液（pH值为3.6）；称取31.233 mg TPTZ并用40 mmol/L的盐酸溶解再定容至10 mL，得到10 mmol/L的TPTZ溶液（4 ℃冷藏备用）；称取三氯化铁0.270 3 g并加蒸馏水定容至50 mL，得到20 mmol/L的FeCl3· 6H2O溶液。将上述溶液依次按体积比10：1：1混合均匀，即可得FRAP溶液，需现配现用［3］。

称取0.278 0 g七水合硫酸亚铁加蒸馏水定容至100 mL，即得10 mmol/L的FeSO4溶液（可滴加少量浓硫酸使pH值约为4以防止溶液氧化）。取10 mmol/L的FeSO4溶液，加水稀释定容，配成5、4、2.5、2、1.25、1、0.625、0.312 5 mmol/L不同浓度的FeSO4溶液。

取不同浓度的FeSO4溶液各0.05 mL，加入4.5 mL提前预热至37 ℃的FRAP试剂，混匀，37 ℃水浴下反应10 min后在593 nm下测吸光值，绘制FeSO4标准曲线。

（2）GCBCGA样液还原力的测定。分别移取0.05 mL质量浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的GCBCGA样液于不同试管中，再向各试管加入4.5 mL预热至37℃的FRAP试剂，混匀，37 ℃水浴反应10 min后测该溶液在波长593 nm处的吸光值。平行试验3次取平均值，由标准曲线得出不同吸光值下FeSO4浓度，此浓度值即为FRAP值。以不同浓度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的抗坏血酸（Vc）作对比试验。

1.3.2 DPPH自由基清除率的测定

（1）DPPH标准曲线的绘制。分别准确称取DPPH标准品0、0.79、1.58、2.37、3.15和3.94 mg于100 mL棕色容量瓶中，再用95%的乙醇充分溶解并定容至100 mL，即可得到浓度分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mmol/L的DPPH标准溶液，将其避光保存，备用。分别取不同浓度的DPPH标准溶液在517 nm波长下测吸光值，绘制DPPH标准曲线。

（2）GCBCGA样液DPPH自由基清除率的测定。配0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/mL不同浓度的GCBCGA样液，各取1 mL的GCBCGA样液和2 mL的0.1 mmol/L DPPH醇溶液混匀，不同浓度1 mL GCBCGA 样液和2 mL的95%乙醇混匀，0.1 mmol/L DPPH醇溶液2 mL和95%乙醇1 mL混匀，避光放置30 min后在517 nm波长下分别测吸光度Ai、Aj、A0。做3组平行试验，取平均值。以上试验均以抗坏血酸（Vc）做阳性对照。按下式计算自由基清除率AE［4］：

用标准曲线所测得吸光值可计算残留率，可与上述清除率比对验证，残留率CREM计算公式如下［5］：

式中 Ct—— t时刻的DPPH自由基的摩尔浓度，mmol/L；

C0—— 初始DPPH自由基的摩尔浓度，mmol/L。

1.3.3 影响抗氧化稳定性的试验

（1）光照时间对抗氧化稳定性的影响。取10 mL 浓度为0.8 mg/mL的GCBCGA 样液两组，分别置于无光条件下和完全遮挡自然光并用日光灯持续照射条件下，在第0、3、6、9天分别取样按上述1.3.2（2）中方法进行试验，测吸光度得自由基清除率，比较在不同时间下光照的影响因素。

（2）pH值对抗氧化稳定性的影响。取10mL浓度为0.8 mg/mL GCBCGA 样液6组，分别调pH值至2、4、6、8、10、12的，24 h后取样进行试验，测吸光度得自由基清除率，比较不同pH值对DPPH自由基清除率的影响。

（3）温度对抗氧化稳定性的影响。将0.8 mg/mL GCBCGA 样液分装10mL于带塞试管中，分别置于40 ℃、60 ℃、80 ℃不同温度的恒温水浴锅中，一组在室温下（20±2）℃，于0、30、60、90、120、150 min时，取样按上述1.3.2（2）中方法进行试验后测吸光度得自由基清除率。

2 结果与分析

2.1 FRAP还原力

（1）FeSO4的标准曲线。以吸光值为纵坐标，FeSO4溶液浓度为横坐标，如图1绘制FeSO4标曲，得线性回归方程：y=0.216 1x-0.060 3，相关系数R2=0.999 2，线性范围：0～5 mmol/L，标准曲线线性关系良好。

（2）GCBCGA样液还原力的测定。图2中，主次纵坐标的GCBCGA样液和Vc浓度为自变量，两者浓度范围不同，FRAP值为因变量。当样液和Vc浓度均为0.4 mg/mL时，对应的FRAP值分别为3.45 mmol/L和6.69 mmol/L，后者是前者的1.94倍。相同FRAP值下，所需GCBCGA样液浓度明显大于Vc的浓度。增加相同量的FRAP值，所需GCBCGA样液浓度比所需Vc的浓度高。可见GCBCGA的还原能力不如Vc。

2.2 DPPH自由基清除能力

（1）DPPH的标准曲线。以DPPH醇溶液的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制DPPH的标准曲线。由图3可得，线性回归方程：y=11.283x+0.003 5，相关系数R2=0.999 3，线性范围：0～0.1 mmol/L，标准曲线线性关系良好。

（2）GCBCGA自由基清除率的测定。由吸光值计算可得DPPH自由基清除率AE值如图4，AE值随着GCBCGA 样液浓度的增加而增大，当其浓度为0.75 mg/mL和1 mg/mL时AE值分别为88.45%和92.97%，逐渐趋于稳定，表明浓度为0.75 mg/mL已清除约90%的DPPH自由基。阳性对照Vc的AE值也随着浓度增加而增大，当Vc浓度为0.5 mg/mL时清除率达到约90%。GCBCGA 样液浓度为0.75 mg/mL时的清除率相当于0.5 mg/mL的Vc的清除率，当两者浓度均为0.75 mg/mL时，两者的AE值相当。以上表明GCBCGA 具有一定的抗氧化能力，但抗氧化能力不如Vc。

用标准曲线所测得的吸光值计算残留率CREM，GCBCGA样液的清除率AE和残留率CREM如表1。

表1 GCBCGA的清除率AE和残留率CREM

理论上，不同浓度下的AE和CREM之和都为100%，由表1可知，误差均在2%以内，说明试验误差较小，数据可靠。

2.3 抗氧化稳定性

（1）光照时间对抗氧化稳定性的影响。由图5可知，在0～9天避光和光照条件下，DPPH自由基清除率均呈逐渐下降趋势，避光条件下GCBCGA样液的清除率下降了11.77%，光照条件下清除率下降了31.73%，下降率约是避光条件下的3倍。由于GCBCGA结构中的酯键、不饱和双键及多元酚具有光化学活性，这些光不稳定因素在紫外线照射下，极易发生光降解作用而使GCBCGA含量下降，造成与DPPH自由基结合率下降使清除率变低。因此，光照时间对GCBCGA的DPPH自由基清除率的稳定性影响较大。

（2）pH值对抗氧化稳定性的影响。由图6可知，DPPH自由基清除率随着pH值先缓慢增大再快速降低，当pH值为6时，DPPH自由基清除率最大为85.35%。相比pH为6时，pH为2时的清除率低了10.62%，pH值为12时的清除率低了60.49%。说明pH值对GCBCGA的抗氧化稳定性有显著性影响。GCBCGA在低pH值环境下可以更稳定的存在，酸性条件可以对GCBCGA结构起到一定的保护作用，抑制了氢离子的释放，降低了与DPPH自由基的结合率，而其在碱性条件下则十分活泼。

（3）温度对抗氧化稳定性的影响。由图7可知，在150 min内，室温（20±2 ℃）下，DPPH自由基清除率无明显变化，在40、60和80 ℃下，随着水浴时间延长，分别取样测得与初始清除率相比浮动均小于5%，说明温度对GCBCGA的DPPH自由基清除率稳定性无显著影响。

3 结语

本文采用2种方法对GCBCGA进行了体外抗氧化活性的测定，通过试验证明了GCBCGA具有一定体外抗氧化活性。GCBCGA样液抗氧化能力与其浓度呈正相关，说明GCBCGA具有一定的抗氧化能力，但抗氧化能力不如Vc。稳定性试验证明温度对GCBCGA的抗氧化性稳定性影响有限；光照对其抗氧化稳定性有一定程度影响。pH值对抗氧化稳定性的影响显著，其在酸性条件下更稳定，而在碱性条件下极其不稳定。本文通过探究GCBCGA抗氧化活性为天然抗氧化剂的发展提供了试验依据。