保加利亚乳杆菌制备有机纳米硒的研究

吴国杰，林学贵，陈 琳，刘 永

（1.仲恺农业工程学院 化学化工学院，广州 510225；2.肇庆学院 食品与制药工程学院，广东肇庆 526061）

0 引言

硒是人体内重要的微量元素之一，对于人体的新陈代谢以及免疫功能起到很重要的作用。世界卫生组织建议人们每天补充适量的硒，提高免疫力和预防许多种疾病［1］。适当补充硒元素对于人体的代谢和免疫有很大的好处，人们生活中通过水果、青菜等绿色食品摄取硒低，难以满足人们对硒的需求［2］。所以生物活性高、易吸收、低毒性硒的制备显得非常重要。

纳米硒粒径小、表面活性中心多、生物活性高、毒性低、易吸收利用、稳定性高，是目前最有效最安全硒源［3］。研究表明，纳米硒具有良好抗癌、提高免疫力、抗氧化、促进生长以及提高生殖能力作用［4-7］。研究如何更快捷便利制备有效的纳米硒是目前重要的研究内容之一。Oremland等发现可以利用生物转化合成有机纳米硒［8］，Fesharaki等通过肺炎克雷伯氏菌将硒化物转化形成有机纳米硒［9］。

乳酸菌是益生菌，对促进消化、肠胃健康等有很大帮助，广泛应用于食品、制药、生物技术等领域［10-11］。刘文群等［12］利用保加利亚乳杆菌新陈代谢将无机铬转化成细胞内的有机铬，有机态铬吸收迅速，且安全性和利用率高。保加利亚乳杆菌自身的生物转化作用能将乳酸菌以及其产生的乳酸菌素和微量元素的益处结合于一起。本研究采用保加利亚乳杆菌为载体，通过其自身的新陈代谢吸收亚硒酸钠，制备有机纳米硒，对制备工艺进行优化，并利用扫描电子显微电镜对制备的有机纳米硒进行形貌分析，为有机纳米硒的生物制备提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛肉浸膏、酵母提取粉、细菌学蛋白胨购于广东环凯微生物科技有限公司；葡萄糖、磷酸氢二钾、柠檬酸三钠、七水合硫酸镁、硫酸锰、乙酸钠、吐温-80、琼脂粉购于天津市福晨化学试剂厂；亚硒酸钠购于山东西亚化学工业有限公司；硒代甲硫氨酸购于上海麦克林生化科技有限公司，其他试剂均为分析纯。

XSP-5CA生物显微镜（上海光学仪器六厂）、AFS-2000双道原子荧光光度计（北京科创海光仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 MRS培养基的制备

将牛肉浸膏10 g、酵母提取粉10 g、葡萄糖10 g、细菌学蛋白胨10 g、磷酸氢二钾2 g、柠檬酸三钠5 g、七水合硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g、乙酸钠5 g、吐温-80 1mL（固体培养基加入2%的琼脂粉加热至沸腾），溶解于1 000 mL蒸馏水。使用HCl溶液调pH值至6.2～6.4，培养基分装入250 mL锥形瓶，包装标记后放入高压蒸汽锅。121 ℃高压灭菌25 min后，冷却备用（或冷却至45 ℃左右倒平板，培养皿倒置备用）。

1.2.2 保加利亚乳杆菌菌种的提纯

将1 g酸奶发酵粉加入MRS液体培养基，放置于37 ℃培养箱24 h。取0.2 mL菌液均匀滴加于固体培养基表面，用涂布器涂匀，于37 ℃培养箱倒置培养2～3天。接种针挑取单个菌落，在固体培养基表面平板划线，37 ℃培养箱倒置培养2～3天。接种针挑取单菌落，将其接种于液体培养基，37 ℃培养箱培养24 h，制成菌液备用。

1.2.3 菌种鉴定

参考周家春［13］的方法。菌种形态鉴定：采用革兰氏染色法染色，菌种预处理后，在电子显微镜下观察。生化鉴定：接种环挑取单菌落，接种于细菌微量生化鉴定管，培养24～48 h后观察鉴定管的颜色变化。

1.2.4 纳米硒的制备

取1 mL菌液接种于100 mL液体培养基中，振荡摇匀，放置生化培养箱37 ℃活化24 h。取已活化的菌液接种于150 mL液体培养基中，振荡摇匀，放置生化培养箱37 ℃扩大培养15 h。加入一定浓度的亚硒酸钠溶液，摇匀后放置生化培养箱37 ℃反应48 h。将上述溶液在离心机转速为4 000 r/min条件下离心3 min，用去离子水洗涤沉淀物，上清液再离心一次，上述步骤重复3次，沉淀物烘干得到有机纳米硒产品。

1.2.5 产品硒含量的测定

根据李刚［14］的方法稍作修改。准确称取0.05 g产品，倒入小烧杯，加入5 mL混酸溶液（HNO3：HClO4=4：1），冷消一晚上。放置电热板上热消4 h以上，直至有浓烈的白烟，加入5 mL 50% HCl溶液，加热至溶液体积为1～2 mL。将消化完的产品倒入100 mL容量瓶，适量的高纯水洗涤小烧杯中残留的液体后，倒入容量瓶，使用高纯水定容。移液枪取1 mL定容溶液于100 mL容量瓶，加入60 mL 50% HCl溶液，使用高纯水定容，在原子荧光光度计上测定。根据使用亚硒酸钠标准溶液得到的标准曲线计算得到产品硒含量：

1.2.6 正交试验优化纳米硒的制备

在单因素试验的基础上，根据正交试验设计原理，以产品硒含量为优化指标，选择亚硒酸钠浓度、保加利亚乳杆菌接种量、培养时间、培养温度4因素3水平进行优化纳米硒制备工艺。

1.2.7 扫描电子显微电镜观察

根据肖媛［15］的方法，将产品喷金后进行扫描电镜，观察产品的形貌。

1.2.8 硒代甲硫氨酸含量的测定

称取适量样品，依次加入30 mmoL/LTris-HCl缓冲溶液5 mL和20 mg胃蛋白酶XIV，涡旋30 s混匀，放于37 ℃恒温箱中孵育24 h，取出冷却后10 000 r/min离心10 min，取上清液过0.45 μm滤膜，稀释20倍后，以硒代甲硫氨酸为标准物，在1290-6460液相色谱仪质谱仪（Agilent）上测定硒代甲硫氨酸含量。

1.3 数据处理

数据平行测定3次，采用SPSS20进行差异性分析，p＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 保加利亚乳杆菌的筛选

从图1（a）可知，保加利亚乳杆菌菌落在MRS培养基上，菌落颜色为淡白色或透明，形状呈圆点，表面质地光滑。保加利亚乳杆菌具有将亚硒酸钠转化成红色单质硒的能力。挑选具有保加利亚乳杆菌菌落特征的单菌落，接种划线至添加亚硒酸钠的MRS培养基上，在培养箱37 ℃培养3～5天，结果见图1（b）。成型的菌落是光滑小圆点，颜色呈红色，即为保加利亚乳杆菌。

2.2 保加利亚乳杆菌的鉴定

采用革兰氏染色法染色、制片，采取生物显微镜观察其形态，镜检结果：革兰氏阳性菌且细胞形状呈现杆状。为更加准确确认上述乳杆菌为保加利亚乳杆菌，避免其他杆菌影响。根据乳杆菌的生化特性，参考周家春［11］的方法进行鉴定。将菌液接种于相应的生化鉴定发酵管，于培养箱37 ℃培养24 h后观察其颜色变化，鉴定结果如表1所示。由表1可知乳糖发酵试验为阳性，麦芽糖和七叶苷发酵试验都为阴性，即为保加利亚乳杆菌。

表1 杆菌的生化特征

2.3 亚硒酸钠浓度对硒含量的影响

由图2可知，随着亚硒酸钠浓度的上升，产品硒含量增加，当亚硒酸钠浓度为0.6 mg/mL时硒含量最大，之后呈下降趋势。亚硒酸钠浓度水平对硒含量差异性显著（p＜0.05），所以制备纳米硒时亚硒酸钠浓度为0.6 mg/mL较为合适。

2.4 保加利亚乳杆菌接种量对硒含量的影响

由图3可知，随着保加利亚乳杆菌接种量的增加，产品硒含量增加并在8%处达到最大值，之后呈现下降趋势。保加利亚乳杆菌接种量水平对硒含量差异性显著（p＜0.05），所以制备纳米硒时保加利亚乳杆菌接种量为8%比较合适。

2.5 培养时间对硒含量的影响

由图4可知，产品硒含量随着培养时间的增加先增加后降低，在60 h达到峰值。培养时间水平对硒含量差异性显著（p＜0.05），所以制备纳米硒时培养时间为48 h比较合适。

2.6 起始培养基pH值对硒含量的影响

由图5可知，产品硒含量随MRS液体培养基起始pH值的增加逐渐降低。这可能在酸性条件下，会促进保加利亚乳杆菌的新陈代谢，而碱性条件促进保加利亚乳杆菌的生长与分裂。所以固定起始培养基pH值为6.2不变进行优化试验。

2.7 培养温度对硒含量的影响

由图6可知，随着培养温度的上升，产品硒含量逐渐增加，当温度高于43 ℃，硒含量开始下降。培养温度水平对硒含量差异性显著（p＜0.05），所以制备纳米硒时培养温度为43 ℃比较合适。

2.8 正交试验优化制备有机纳米硒

在分析A（亚硒酸钠浓度，mg/mL）、B（培养温度，℃）、C（培养时间，h）和D（保加利亚乳杆菌接种量，%）的单因素试验基础上，以产品硒含量（mg/g）为优化指标，固定起始培养基pH值为6.2不变，对亚硒酸钠浓度、培养温度、培养时间和保加利亚乳杆菌接种量采用4因素3水平正交试验进行优化有机纳米硒制备工艺，试验结果与直观分析见表2。极差R值的大小，表示该列因素在试验范围内的变化对试验结果影响的大小。R值越大说明该列因素对试验结果的影响越显著。从表2可知，4因素对硒含量的影响顺序为培养时间（C）＞保加利亚乳杆菌接种量（D）＞亚硒酸钠浓度（A）＞培养温度（B），有机纳米硒的最优制备工艺为A2B3C2D1。根据最优制备工艺进行3次平行试验，产品硒含量的平均值为68.23%。

表2 L9（34）正交试验设计及直观分析

2.9 纳米硒形貌分析

从扫描电镜图（略）可看出，保加利亚乳杆菌制备的红色有机纳米硒呈现规则颗粒状，表面较为光滑，制备得到的有机纳米硒粒径为300～400 nm。

2.10 硒代甲硫氨酸的含量分析

以硒代甲硫氨酸为标准物，利用液相色谱仪质谱仪测定反应前保加利亚乳杆菌、反应后产物中硒代甲硫氨酸的含量。硒代甲硫氨酸的标准曲线为y=545.05x-101.03（R2=0.999 99），保加利亚乳杆菌、产物中硒代甲硫氨酸的含量分别0.0，6.04 mg/kg，说明上述推理成立。

3 结语

在分析单因素试验的基础上，采用正交试验优化有机纳米硒的制备工艺。各因素对硒含量的影响顺序为培养时间＞保加利亚乳杆菌接种量＞亚硒酸钠浓度＞培养温度。有机纳米硒的最佳制备工艺为亚硒酸钠浓度0.6 mg/mL、培养温度46 ℃、培养时间60 h、保加利亚乳杆菌接种量6%和起始培养基pH 6.2，此条件下产品的硒含量为68.23%。保加利亚乳杆菌制备有机纳米硒呈现规则颗粒状，表面较为光滑，粒径为300～400 nm。