HPV16 E5 蛋白免疫优势肽段分析及其多克隆抗体的制备

唐婉林，王路得，顾美萍，Kamara SAIDU，汪琪，李明洋，陈韶，张丽芳

温州医科大学微生物学与免疫学教研室,浙江温州325035

宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤之一,在全球女性恶性肿瘤中发病率仅次于乳腺癌居第二位［1］。人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)高危型别16、18、31、33、45、58 等感染与宫颈癌的发生和发展密切相关。尽管HPV 高危型别感染呈区域或地区分布特点,但研究表明,全球诱发宫颈癌的主要型别为HPV16 和18,尤其以HPV16 多见,约占宫颈癌组织细胞中 HPV 检测的 85%［2］。HPV16 可通过表达E6 和E7 肿瘤蛋白诱发宫颈癌,目前对E6 和E7 蛋白的致癌机制研究表明,E6 和E7 蛋白可分别通过抑制宫颈细胞抑癌基因p53 和pRB 的表达,诱导宫颈细胞恶性转化并发展为宫颈癌。而HPV16 E5 蛋白主要在宫颈癌发生的早期阶段发挥诱导细胞恶性转化作用,即可通过增强表皮生长因子(epidermal augmentum factor,EGF)表达,干扰宿主免疫应答和增进病毒免疫逃逸,抗凋亡和促进血管生成,并与E6和E7 蛋白在增强细胞永生化潜能方面具有协同作用等,发挥着早期诱导细胞恶性转化的作用。因此,E5 蛋白是诱发早期宫颈恶性转化的蛋白之一,也是早期靶向治疗和分子诊断的靶抗原之一［3］。

本研究通过生物信息学方法分析HPV16 E5 蛋白的免疫优势肽段,进一步通过免疫白兔的方法制备高效价多克隆抗体并鉴定其免疫原性,通过间接细胞免疫荧光试验验证多克隆抗体识别和结合HPV16 E5 蛋白的特异性,为HPV16 E5 蛋白的生物学特性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级日本大耳白兔,雌性,6 ～8周龄,体重4 ～5 kg,购自温州医科大学实验动物中心,合格证号:SYXK(浙)2014-0006。

1.2 细胞 TC-1 细胞为温州医科大学基础医学院微生物与免疫实验室前期保存,TC-1-E5 细胞由该实验室前期构建并保存。

1.3 主要试剂及仪器 匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、TMB 显色液均购自美国Sigma 公司；脱脂奶粉购自美国BD 公司；浓硫酸、吐温、戊二醛购自温州金山试剂公司；HRP-羊抗兔IgG(H + L)购自杭州联科生物有限公司；Hoechst33258、抗荧光猝灭剂、Cy3 羊抗兔Ig(H + L)购自碧云天生物技术有限公司；甘氨酸、山羊血清购自北京Solarbio 公司；Bio Elx 800 酶标仪购自美国Bio-tek 公司。

1.4 HPV16 E5 蛋白氨基酸序列的获取 从瑞士生物信息网站的 Swissport 蛋白数据库(http:／ ／ www.expasy.org ／)获取 HPV16 E5 的全长氨基酸序列(PRO-0000133289)。

1.5 HPV16 E5 蛋白二级结构的预测 分别采用EXPASY(http:／ ／ www.expasy.org ／ proteomics ／)在线服务器中的 GOR［4］和 SOPMA［5］软件进行分析预测。

1.6 HPV16 E5 蛋白跨膜结构的预测 分别采用Expasy 在线服务器中的TMPRED 和PROTSCALE软件进行分析预测。

1.7 HPV16 E5 蛋白亲水性、表面可及性、抗原性、极性和柔韧性参数的预测 用Expasy(https:／ ／ web.expasy.org ／ protscale ／)分析预测 E5 蛋白的 HOOP ＆WOODS 亲水性［6］、Emini 表面可及性,用 DNAstar分析E5 蛋白的Jameson-Wolf 抗原性、Zimmerman极性［7］及柔韧性。

1.8 HPV16 E5 蛋白细胞毒性T 细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位的预测 用Syfpeithi［8］(http:／／www.syfpeithi.de ／)分析预测 E5 蛋白的 CTL 抗原表位。

1.9 综合分析 综合以上参数,分析HPV16 E5 蛋白B 细胞表位的优势位点,并采用吴玉章等［9］建立的抗原性指数(antigenic index,AI)综合分析。筛选含HPV16 E5 蛋白B 细胞表位,同时参考CTL 表位,筛选HPV16 E5 蛋白的免疫优势肽段。

1.10 E5 免疫优势肽段的合成及动物免疫 选择含E5 可能的B 细胞表位和CTL 表位的N-端氨基酸序列肽段,即E-ZLF102(MTNLDTASTTLLACFLL,aa 1 ～17),由上海波泰生物科技有限公司进行多肽合成。并将白兔分为 3 组,即 E-ZLF102、KLH 和 PBS 组,每组3 只。其中 E-ZLF102 组为E-ZLF102 多肽与KLH 偶联后免疫,偶联比例:根据KLH 与多肽的摩尔质量比1︰100,经计算质量比约为1︰1,即加入等量的KLH 和多肽。将KLH 与多肽混合后,缓慢滴加1 mL 0.3%戊二醛溶液,置冰中,脱色摇床振荡反应2 h,溶液变成黄色后,加入1 mol ／ L 甘氨酸作用30 min,终止反应,将反应物于PBS 溶液中4 ℃透析过夜,4 ℃保存待用。

实验前采集白兔血清,作为阴性对照。按照0、2、4、6 周免疫程序进行免疫,首次免疫佐剂采用完全弗氏佐剂,第2 ～4 次免疫采用不完全弗氏佐剂,分别与抗原等量混匀并充分乳化,每次每只家兔背部皮下多点注射500 μg E-ZLF102 多肽抗原、KLH蛋白和PBS 对照。同时,于2、4、6 周自兔耳缘静脉采血,第8 周兔心脏取血,4 ℃,1 500×g 离心20 min,收集上层血清,置-80 ℃保存备用。

1.11 多克隆抗体反应及效价的ELISA 检测 取0、2、4、6、8 周血清,按 1 ∶1 000 稀释后,ELISA 法检测3 组血清与HPV16 E5 E-ZLF102 免疫优势肽段结合的特异性。将无偶联KLH E-ZLF102 多肽抗原按20 μg ／ mL 比例稀释后包被 ELISA 板,4 ℃过夜；PBST 洗涤3 次,PBST-5%脱脂奶粉37 ℃封闭 1 h；加入倍比稀释后第8 周的白兔免疫血清(分别按1 ∶160、1 ∶640、1 ∶2 560、1 ∶10 240 和 1 ∶40 960 稀释),37 ℃孵育 1 h；PBST 洗涤 3 次,加入 HRP-羊抗兔 IgG(H + L)(1 ∶5 000 稀释),37 ℃孵育 1 h；置 Bio Elx 800 酶标仪于450 nm 波长处读取A 值。所有血清样本均重复检测3 孔,设KLH 组为阴性对照组,并设PBS 组为空白对照组。

1.12 多克隆抗体特异性的间接细胞免疫荧光试验分别将 TC-1-E5 和TC-1 细胞以每孔 2 × 104个接种放置盖玻片的6 孔板中,细胞培养箱37 ℃培养24 h至长成单层细胞,取出盖玻片,经40 g ／ L 多聚甲醛固定后,1 g ／ L Triton X-100 处理 10 min,加入 20%山羊血清37 ℃封闭1 h；经PBS 洗涤后,每孔分别加入 HPV16 E5 E-ZLF102 组、KLH 组和 PBS 空白对照组兔血清(均 1 ∶2 000 稀释),4 ℃过夜；洗涤后,每孔加入 Cy3 羊抗兔Ig(H + L)(1 ∶1 000 稀释),37 ℃孵育 1 h；加入 Hoechst33258 衬染细胞核(1 ∶1 000 稀释)；PBS 洗涤、封片,荧光显微镜下观察拍照。试验设未转染E5 的TC-1 细胞及KLH 组血清、PBS 组血清作为对照。

1.13 统计学分析 采用SPSS V 21.0 软件进行统计学分析,组间比较采用配对t 检验,以P﹤0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HPV16 E5 蛋白的氨基酸序列 HPV16 E5 蛋白由83 个氨基酸组成,相对分子质量约为9 400,等电点(pI)为8.30。氨基酸序列见图1。

图1 HPV16 E5 蛋白的氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequence of HPV16 E5 protein

2.2 HPV16 E5 蛋白的二级结构 结果显示,E5 蛋白的二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,β-转角相对较少。两种方法预测HPV16 E5 蛋白的二级结构的构成比［n = 83,n(%)］,GOR 法:α-螺旋 23(27.7%)、β-折叠27(32.5%)、无规则卷曲33(39.8%)；SOPMA 法:α-螺旋 59(71%)、β-折叠 11(13.3%)、无规则卷曲13(15.7%)。取两种方案中预测结果一致的重叠区,可见无规则卷曲主要位于N-端氨基酸序列的1 ～ 5、29 ～ 35,见图 2。

图2 HPV16 E5 蛋白的二级结构Fig.2 Secondary structure of HPV16 E5 protein

2.3 HPV16 E5 蛋白的跨膜结构 结果显示,E5 蛋白为跨膜蛋白,其3 处跨膜区域分别位于N-端氨基酸序列的 10 ～ 28、42 ～ 62 和 63 ～ 83 处,见图 3。

图3 HPV16 E5 蛋白的跨膜区域预测Fig.3 Prediction of transmembrane region of HPV16 E5 protein

2.4 HPV16 E5 蛋白的亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数 结果显示,应用不同参数预测的B 细胞抗原表位肽段略有差异,但E5 的N-端氨基酸片段2 ～7(抗原指数 ≥ 0,亲水性指数 ≥ 0,表面可及性指数 ≥ 1)在多种预测方法中一致,见图 4 和表 1。

2.5 HPV16 E5 蛋白的 CTL 表位 HLA-A2 和 HLAA3 限制性表位分析结果显示,CTL 表位可能位于N-端氨基酸序列的 3 ～ 11、11 ～ 19、15 ～ 23 处,见表 2和表3。

图4 HPV16 E5 不同参数的预测结果Fig.4 Prediction of various parameters of HPV16 E5 protein

表1 不同参数预测结果区域Tab.1 Regions of prediction results of various parameters

表2 HPV16 E5 来源的HLA-A2 限制性表位预测结果Tab.2 Prediction of HLA-A2 restricted epitopes from HPV16 E5

表3 HPV16 E5 来源的HLA-A3 限制性表位预测结果Tab.3 Prediction of HLA-A3 restricted epitopes from HPV16 E5

2.6 综合分析结果 HPV16 E5 蛋白 N-端 2 ～7(NLDTAST)显示出较好的亲水性、柔韧性、表面可及性及抗原性,在二级结构上易于形成无规则卷曲和转角,是可能B 细胞线性肽段位置。计算HPV16 E5 蛋白B 细胞可能的表位区段AI,结果显示,HPV16 E5 蛋白 N-端 2 ～ 7 肽段 AI 为 0.031,29 ～ 42 肽段AI 为0.021,经同源性分析,与HPV 其他型别E5 无同源性。本研究筛选含有可能B 细胞表位(N-端2 ～7 肽段)和3 个CTL 表位在内的N-端氨基酸序列(MTNLDTASTTLL ACFLL,aa 1 ～17)作为免疫优势表位,进一步进行免疫原性分析和鉴定。

2.7 多克隆抗体反应及效价 在抗原免疫后约2周,家兔开始产生特异性抗体,并于第8 周达到最大值。0、2、4、6、8 周血清按 1 ∶1 000 稀释后,ELISA法检测各组血清与HPV16 E5 E-ZLF102 免疫优势肽段结合的特异性,结果显示,HPV16 E5 免疫优势肽段E-ZLF102 组兔于免疫后4 周开始产生HPV16 E5 优势表位特异性抗体,并随时间延长抗体滴度逐渐增加。E-ZLF102 组产生的抗体效价在第8 周与KLH 和PBS 组比较,差异有统计学意义(t 分别为50.16 和 38.91,P﹤0.001),见图 5。用 ELISA 法检测稀释后第8 周兔血清,结果显示,HPV16 E5 免疫优势肽段E-ZLF102 血清抗体效价可达1 ∶10 000以上,见图6。

图5 ELISA 法检测HPV16 E5 多肽多克隆抗体反应Fig.5 ELISA of reaction of polyclonal antibody against HPV-16 E5

图 6 ELISA 法检测家兔血清中抗HPV16 E5 多克隆抗体效价Fig.6 ELISA titer of anti-HPV16E5 polyclonal antibody in rabbit sera

2.8 多克隆抗体的特异性 结果显示,在TC-1-E5 细胞中,HPV16 E5 多肽E-ZLF102 免疫组胞浆内可见斑点状的红色特异性结合团块,KLH 和PBS 组则未见特异性结合的染色信号；而在未转染HPV16 E5基因的TC-1 细胞中,3 组兔血清抗体均未见特异性结合的染色信号。见图7。表明HPV16 E5 多肽EZLF102 组多克隆抗体可特异性识别稳转TC-1 细胞表达的E5 蛋白。

图 7 间接细胞免疫荧光试验检测多克隆抗体与抗HPV16 E5 蛋白结合能力(× 400)Fig.7 IFA of binding capacity of polyclonal antibody to anti-HPV16 E5 protein(× 400)

3 讨 论

抗体是B 细胞受到外界抗原刺激后分化为浆细胞分泌的具有清除抗原作用的蛋白质。抗体分为单克隆抗体、多克隆抗体和基因工程抗体3 种,其中以多克隆抗体的制备最简单,成本较低,通常为众多研究的首选［10］。HPV16 E5 蛋白在宫颈癌早期发生过程中起重要作用,提示HPV16 E5 蛋白的研究可为阐述宫颈早期病变损伤的机制奠定基础,也可为早期宫颈病变的治疗及预防提供可能的靶标。本研究分析了HPV16 E5 蛋白的二级结构、亲水性、抗原性、表面可及性、CTL 表位等生物信息学参数,并结合抗原指数分析,确定其可能的B 细胞表位位于N-端aa 2 ～7。本研究将含有B 表位及多个CTL 表位的 HPV16 E5 蛋白 N-端(MTNLDTASTTLLACFLL,aa 1 ～17)序列肽段作为免疫优势肽段进行了免疫原性分析,并对制备的多克隆抗体的效价及特异性进行了验证。选择免疫优势肽段(aa 1 ～17),其中E5蛋白可能B 细胞表位位于N-端aa 2 ～7 区段,而跨膜区位于N-端aa 10 ～28 区段,经预测分析主要为CTL表位。研究结果显示,免疫优势肽(MTNLDTASTTLLACFLL)免疫日本大白耳兔后,其多克隆抗体效价随免疫次数的增加而逐渐升高,且通过间接免疫荧光试验分析,多克隆抗体可特异结合HPV E5 蛋白稳转的细胞株(TC-1-E5)表达的E5 靶蛋白。表明,HPV16 E5 蛋白 N-端(MTNLDTASTTLLACFLL,aa 1 ～17)序列肽段具有良好的免疫原性,并可制备多克隆抗体。同时也提示生物信息学分析和筛选免疫优势肽的方法具有较高的可靠性。鉴于目前尚无HPV16 E5 蛋白的商业化抗体,本研究获得的HPV16 E5 特异性多克隆抗体,可为进一步研究HPV16 E5 蛋白的生物学特性奠定实验基础。