中国B 群流脑菌株不同变异群H 因子结合蛋白保护性抗原的筛选

刘建东，张静飞，徐颖之，刘建凯，郑海发

北京民海生物科技有限公司结合疫苗新技术研究北京市重点实验室,北京102600

流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)属于我国规定的乙类传染病,是一种由革兰阴性脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides,Nm)导致的以急性脑脊髓膜炎和败血症为主要症状的通过呼吸道传播的传染病,婴幼儿和青少年是发病的主要人群。根据流脑荚膜多糖的特征将Nm 分为13 个血清群,其中超过95%的流脑感染是由 A、B、C、W135、Y 这 5 个血清群导致的［1-3］。针对 A、C、Y、W135 血清群的疫苗已经研制成功并能有效预防相应菌株的感染。我国因B 血清群Nm 导致的流脑感染近年有增多趋势,因此研制出B 群流脑疫苗具有十分重要的意义。由于B 血清群Nm 的荚膜多糖免疫原性低,且与人类神经组织细胞的N-乙酰神经氨酸成分结构类似,可能引起自身免疫性疾病,因此荚膜多糖不适合作为研发B 群流脑疫苗的候选抗原［4］。

H 因子结合蛋白(factor H binding protein,fHbp)是一种位于Nm 菌体表面的脂蛋白,能特异性结合人类补体调节蛋白H 因子。H 因子是一种在补体替代途径中具有重要作用的生物因子,fHbp 可使H 因子与Nm 表面结合,从而减少补体介导的杀菌作用。有研究发现,H 因子能抵制免疫系统对B 血清群Nm 的杀伤作用,去除H 因子的血清会显著提高对流脑菌株的杀菌能力［5-6］。fHbp 是一个有前景的B 群流脑疫苗候选抗原,该蛋白几乎表达在所有流脑菌株表面,诱导的血清抗体具有广谱性的杀菌活性,其作用机制是fHbp 蛋白诱导的血清抗体既能激活经典补体系统导致菌体裂解,也能抑制补体抑制因子H 对菌体表面的结合。fHbp 结合H 因子后可使B群脑膜炎菌株增强补体系统介导的杀菌效应。fHbp作为疫苗抗原的一个主要限制是其在不同B 群流脑菌株中的变异性。根据蛋白基因序列可将fHbp 蛋白主要分为3 个变异群V1、V2 和V3,fHbp 的同源性在同一个变异群内为91.6%～99.0%,最低为62.8%,变异群间交叉保护很低,变异群内fHbp 蛋白诱导产生的的抗体仅能对fHbp 同一变异群内的菌株具有杀菌活性［7］。

欧美地区主要流行的B 群流脑菌株的fHbp 基因属于V1 和V3 变异群,而中国流行的B 群流脑菌株的fHbp 基因主要为V1 和V2 变异群。中国疾病预防控制中心通过对中国流行B 群流脑菌株的fHbp 基因的分析显示,fHbp 基因V1 变异群在患者和携带者中所占比例分别为28.0%和8.3%,fHbp基因V2 变异群在患者和携带者中所占比例分别为64.5%和87.9%,fHbp 基因V3 变异群在患者和携带者中所占比例分别为6.5%和0.9%［8］。本文根据中国B 群流脑菌株的流行病学数据选择中国流行菌株不同变异群的fHbp 基因进行基因克隆,以筛选出能诱导产生针对中国流行B 群流脑菌株的杀菌抗体的fHbp 抗原,对研制适合中国流行情况的B群流脑疫苗具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 质粒、细胞、菌株及基因 pET28a 载体由清华大学医学部张敬仁老师实验室提供；E.coli DH5α和BL21(DE3)感受态细胞购自美国Thermofisher 公司；6 种fHbp 基因由中国疾病预防控制中心提供,菌株211009(属于fHbp V3.94)、441304(属于fHbp V2.16)、341215(属于fHbp V1.8)由该中心传染病所邵祝军老师实验室提供。

1.2 主要试剂及仪器 碳酸氢钠、碳酸钠、氯化钠、葡萄糖购自国药集团化学试剂有限公司；酵母粉、蛋白胨、2,3,5-氯化三苯四氮唑、脑心浸液肉汤培养基购自英国Oxoid 公司；primestar 酶、限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自日本TaKaRa 公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自美国OMEGA 公司；BSA、IPTG 购自美国AMERSCO 公司；HRP 标记的山羊抗小鼠IgG 购自北京博奥森生物技术有限公司；幼兔补体购自美国Pel-freeze 公司；哥伦比亚血平板购自上海科马嘉微生物技术有限公司；镍柱填料购自苏州纳微科技有限公司。

1.3 实验动物 SPF 级 BALB ／ c 小鼠,6 周龄,体重18 ～22 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物合格证号分别为:11400700361181 和11400-700282258。

1.4 fHbp 基因原核表达质粒的构建 根据中国B群流脑菌株fHbp 基因的流行情况,选取6 种fHbp抗原基因(其中 V1 基因 1 条、V2 基因 3 条、V3 基因2 条),根据E.coli 的密码子偏好性进行优化合成,用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ对合成的fHbp 基因和pET28a 载体进行双酶切,酶切产物回收后经T4 DNA 连接酶连接,连接产物转化E.coli DH5α 感受态细胞,涂布于含 30 μg ／ mL 卡那霉素的 LB 固体培养基,提取菌落进行PCR 鉴定。PCR 反应条件:95 ℃变性 5 min；95 ℃变性 30 s,60 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 1 min,共 30 个循环；72 ℃延伸 5 min。鉴定正确的质粒送华大基因测序。

1.5 fHbp 蛋白的表达及纯化 将fHbp 基因原核表达质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,涂布于含 30 μg ／ mL 卡那霉素的 LB 固体培养基,37 ℃培养过夜；加入IPTG 至终浓度为0.5 mmol／L,37 ℃诱导2 h；将菌液接种至10 mL LB 液体培养基中,37 ℃180 r ／ min 培养过夜；将菌液接种至 2 L LB 液体培养基中,培养至 A600为 0.2 ～ 0.4 时,加入 IPTG 至终浓度为 0.5 mmol ／ L,16 ℃,180 r ／ min 培养 16 h；15 900 × g 离心,收集表达菌体,10 mmol ／ L PBS 重悬,高压匀浆破碎细胞(破碎压力为600 bar,流速为38 Hz,破碎时间为5 min)；破碎液17 696 × g 离心,收集上清液,用镍柱填料进行亲和纯化。平衡液为10 mmol PBS 溶液,洗脱液分别为含 0.03、0.05、0.1、0.15 和0.4 mol 咪唑的10 mmol PBS 溶液。收集洗脱液,进行12% SDS-PAGE 分析。

1.6 动物分组及免疫 将纯化获得的6 种fHbp蛋白(fHbp V1.5、fHbp V2.16、fHbp V2.18、fHbp V2.19、fHbp V3.31 和 fHbp V3.94)分别与氢氧化铝佐剂吸附后经腹腔免疫BALB ／ c 小鼠,作为抗原组,同时设免疫等体积PBS 溶液的对照组,每组10只,20 μg ／(只·次),免疫 3 次,间隔 3 周,末次免疫后2 周摘眼球取血。后期选取fHbp V2.18 和fHbp V3.94 抗原进行确证试验,用弗氏佐剂作为佐剂,分别经腹腔和肌肉免疫BALB ／ c 小鼠,作为抗原组,同时设免疫等体积PBS 溶液的对照组,每组5 只,20 μg ／(只·次),免疫 3 次,间隔 3 周,末次免疫后 2周摘眼球取血。

1.7 免疫血清抗体滴度的检测 采用ELISA 法。用0.1 mol／L pH 9.6 的碳酸盐缓冲液4 ℃过夜包被fHbp蛋白抗原,包被浓度为 1 μg ／ mL；PBST 溶液洗板 3次,拍干后加入封闭液(2% BSA 溶液),200 μL ／ 孔,37 ℃封闭 1 h；PBST 洗板 3 次,加入免疫血清(用封闭液进行 1 ∶1 000 稀释),37 ℃反应 2 h；PBST 洗板3 次,加入HRP 标记的山羊抗小鼠IgG(封闭液 1 ∶5 000 稀释),100 μL ／ 孔,37 ℃反应 1 h；PBST 洗板3 次,加入 TMB 显色底物显色 5 min；加入 2 mol ／ L硫酸溶液,50 μL／孔,终止反应,用酶标仪测定450 nm波长处的A 值。

1.8 免疫血清杀菌抗体的检测 挑选过夜培养的典型菌落划线接种至哥伦比亚血培养基平板培养4 ～6 h；刮取菌苔至DPBS 缓冲液中混匀,待A600约为0.35 时,用DPBS 缓冲液将菌悬液稀释至终浓度为4 000 CFU ／ mL,与灭活幼兔补体等体积混合,取25 μL 混合液(或直接取 12.5 μL 稀释好的菌悬液)滴种至哥伦比亚血培养基平板,过夜培养后进行细菌计数,平板上生长菌落数为50 ～60 CFU 时,为最优靶菌浓度。取96 孔细胞培养板,每孔加入25 μL DPBS 缓冲液,加入25 μL 待检血清进行倍比稀释后,再加入12.5 μL 未灭活的幼兔补体和12.5 μL菌悬液,同时设阳性对照、补体对照和灭活补体对照孔,摇床上振荡混匀5 min；37 ℃,5% CO2孵育1.5 h；将96 孔板置振荡器上,边振荡边加入含TTC的显色培养基(约 45 ℃),50 μL ／孔,室温放置 5 min；至琼脂彻底凝固,37 ℃,5% CO2孵育过夜；以哥伦比亚血平板上补体对照孔生长的菌落数为原始靶菌数,能够杀死50%以上菌体的最大血清稀释度即为待检血清的杀菌抗体滴度,杀菌抗体滴度第1 孔以1 ∶4 开始。

2 结 果

2.1 fHbp 基因原核表达质粒的鉴定 6 种fHbp 抗原基因扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,均可见约750 bp 的特异性条带,见图1,测序结果显示6 个fHbp 基因均克隆成功。

图1 克隆基因的PCR 鉴定Fig.1 Identification of clone gene by PCR

2.2 纯化的fHbp 蛋白的鉴定 6 种fHbp 蛋白的纯度均超过85%,见图2。

图 2 纯化的fHbp 蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE profile of purified fHbp

2.3 免疫血清的抗体滴度 免疫血清对自身抗原的结合抗体反应的平均滴度均高于1 ∶40 000,其中诱导血清的结合抗体平均滴度最高为fHbp V1.5 抗原组(1 ∶496 025),最低为 fHbp V3.94 抗原组(1 ∶48 500),见图3。fHbp V1.5 抗原诱导血清与其他抗原基本无交叉反应,fHbp V2 抗原与fHbp V2 内的其他抗体有交叉抗体反应,fHbp V2 抗原与fHbp V3 抗体有交叉抗体反应,fHbp V3 抗原内的其他抗体有交叉抗体反应,fHbp V3 抗原与fHbp V2 抗体有交叉抗体反应,见图4。

2.4 免疫血清的杀菌抗体 fHbp V2.18、fHbp V3.31和fHbp V3.94 抗原可诱导产生针对fHbp V3.94菌株的杀菌抗体反应,fHbp V2.16 和fHbp V2.18抗原可诱导产生针对fHbp V2.16 菌株的杀菌抗体反应,针对fHbp V1.8 菌株的杀菌抗体反应较弱,其中fHbp V1.5 抗原不能诱导产生针对fHbp V1.8、fHbp V2.16 和fHbp V3.94 的杀菌抗体反应,见表1 ～3。确证试验结果显示,fHbp V2.18 和fHbp V3.94抗原均可诱导产生针对fHbp V2.16 和fHbp 3.94菌株的杀菌抗体反应,其中肌肉免疫诱导产生的杀菌抗体反应和杀菌抗体诱导率均高于腹腔免疫,两种抗原诱导产生的针对fHbp V1 菌株的杀菌抗体反应均较弱,其中fHbp V2.18 抗原肌肉免疫诱导的针对fHbp V2.16 和fHbp V3.94 菌株的平均杀菌抗体滴度分别为 1 ∶134.4 和 1 ∶56,fHbp V3.94 抗原肌肉免疫诱导的针对fHbp V2.16 和fHbp V3.94菌株的平均杀菌抗体滴度分别为1 ∶200 和1 ∶1 280。见表4。

图 3 fHbp 蛋白免疫血清对自身抗原的结合抗体反应滴度Fig.3 IgG antibody titer of mouse sera immunized by fHbp

图4 fHbp 抗原与诱导抗体的交叉免疫反应Fig.4 Cross antibody response of fHbp antigen and induced antibody

表1 fHbp 抗原诱导产生的针对菌株211009 的杀菌抗体滴度(1 ∶x)Tab.1 Bactericidal antibody titer against strain 211009 induced by fHbp antigen(1 ∶x)

表2 fHbp 抗原诱导产生的针对菌株441304 的杀菌抗体滴度(1 ∶x)Tab.2 Bactericidal antibody titer against strain 441304 induced by fHbp antigen(1 ∶x)

表3 fHbp 抗原诱导产生的针对菌株341215 的杀菌抗体滴度(1 ∶x)Tab.3 Bactericidal antibody titer against strain 341215 induced by fHbp antigen(1 ∶x)

表4 fHbp 抗原确证试验的杀菌抗体滴度(1 ∶x)Tab.4 Bactericidal antibody titer of fHbp antigen in confirmation test(1 ∶x)

3 讨 论

中国流行的流脑菌株主要为 A、B、C、W、Y 血清群,随着A、C、Y、W 血清群流脑菌株荚膜多糖和荚膜多糖结合疫苗的广泛使用,中国B 群流脑在流脑感染中的比例正在不断增加,2015 — 2017 年中国流脑的流行病学数据显示,B 群流脑在中国流行的5种流脑血清群中所占比例高达54.08%,因此,研发B 群流脑疫苗对控制中国流脑的流行至关重要［9］。2000 年,有研究者通过反向疫苗学方法筛选出可诱导针对B 群流脑菌株杀菌抗体的fHbp 抗原,其是一种重要的B 群流脑疫苗研究的抗原［10］。国外已上市的2 个B 群流脑疫苗中均含有fHbp 抗原,其中Trumenba 疫苗仅包含2 种fHbp 抗原。欧美地区B群流脑的流行菌株与中国B 群流脑的流行菌株不同,2 个上市的B 群流脑疫苗中所含fHbp 基因分别为 fHbp V1.1、fHbp V1.45 和 fHbp V3.55,在中国流行的B 群流脑菌株中未发现相应基因,因此,需要筛选符合中国流行B 群流脑菌株的fHbp 抗原进行疫苗研究［8］。本文根据中国B 群流脑的流行情况选取6 个不同变异群的fHbp 抗原基因进行抗原筛选,获得可诱导杀菌抗体的fHbp V2 和fHbp V3 抗原各2 个,进一步的确证试验显示,fHbp V2.18 和fHbp V3.94 抗原均可诱导产生针对fHbp V2 和fHbp V3菌株的杀菌抗体反应,表明fHbp V2 和fHbp V3 之间具有交叉抗体反应。肌肉免疫方式产生的杀菌抗体反应高于腹腔免疫,这可能是由于肌肉和皮下组织中含有更多的巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞,相比于腹腔免疫方式更有利于抗原的摄取和提呈。

尽管筛选获得可诱导产生杀菌抗体反应的fHbp V2 和V3 的蛋白抗原,但本研究未筛选获得可诱导较强杀菌抗体的fHbp V1 的抗原,在B 群流脑菌株中fHbp V1 基因在患者中所占比例为28%,如果在疫苗中增加fHbp V1 抗原会显著增加疫苗的保护效果。已有研究显示,通过融合1 个GNA2091 的蛋白可增加fHbp 蛋白的免疫原性［11］,而本实验室fHbp抗原融合蛋白的研究工作目前正在进行中。已上市疫苗 Bexsero 中还包含 NHBA、NadA 和 OMV 抗原,这些抗原的存在会增加疫苗的保护率,中国B 群流脑疫苗流行病学数据显示,中国B 群流脑中NadA 存在的概率仅为2%［8］,不适合作为疫苗抗原,因此,本实验室筛选NHBA 抗原和评估OMV 作为疫苗成分可能性的研究正在进行中。根据中国流行B 群流脑数据筛选抗原成分,并通过对抗原成分的优化及组合,可研制出适合中国流行情况的B 群流脑疫苗。