不同剂量地西他滨对骨髓增生异常综合征小鼠Beclin1蛋白表达的影响

董 曼，王月莉

(铜川市人民医院血液科，陕西 铜川 727100)

骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic syndrome，MDS)为一种造血干细胞恶性克隆性疾病，病理特征为骨髓造血功能障碍和细胞增殖异常，在临床上可表现为贫血、感染、出血等症状，随病情的发展可进展为白血病[1-2]。随着医学技术的发展，临床上治疗骨髓增生异常综合征的药物与方法越来越多，包括去甲基化药物、化疗、干细胞移植等[3]。DNA甲基化异常是MDS发生的一个重要分子机制，地西他滨到达一定浓度时可抑制DNA 合成，从而诱导细胞死亡[4-5]。现代研究[6-7]表明，小剂量地西他滨可促进小鼠白血病细胞凋亡并抑制细胞增殖，可通过DNA去甲基化机制在体内诱导肿瘤特异性T淋巴细胞免疫应答。自噬相关基因Beclin1是自噬形成过程中的重要调控因子，可调节恶性肿瘤细胞的发生与发展[8-9]。本研究具体探讨不同剂量地西他滨对MDS小鼠Beclin1表达的影响，以明确地西他滨的作用剂量与机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 清洁级、SPF级NOD/SCID小鼠36只，雄性，3～4 周龄，18～22 g，购于北京维通利华有限公司。实验动物生产许可证号：SCXK2021-007。动物合格证号：32343766。小鼠严格饲养于独立通气饲养笼具内，对小鼠所有操作均在生物安全柜内进行，消毒饮用水。实验前经1周严格检验检疫。人骨髓增生异常综合征SKM-1细胞株购自中国科学院细胞资源库。注射用盐酸地西他滨(国药准字H20040958)购自哈尔滨誉衡药业公司(0.2 g/瓶)。BCA法蛋白定量试剂盒等Western blot相关试剂购自美国BD公司，含10%胎牛血清、青霉素及链霉素的RPMI培养液购自美国Sigma公司。抗体购自武汉三鹰公司。手术器械均高温灭菌。动物伦理委员会批准了此次研究。

1.2 MDS小鼠模型制备 收集生长状态良好的 SKM-1细胞，制成密度为5×107/ml 的单细胞悬液，按1×107/ml浓度经鼠尾静脉接种(小鼠接种前2 d腹腔内注射抗鼠CD122单抗200 μg)。

1.3 小鼠分组与治疗 将MDS小鼠模型分为模型组、低剂量组、高剂量组，每组12只。模型组、低剂量组、高剂量组隔天于腹腔内分别注射5 mg/kg生理盐水、5 mg/kg地西他滨、10 mg/kg地西他滨，治疗28 d。

1.4 观察指标 ①观察与记录小鼠一般状况并测定体重；②在治疗第14天和第28天测定小鼠的外周血指标，包括红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)等；③取小鼠外周血分离单个核细胞后，采用流式细胞仪检测与记录CD45+细胞百分比；④在治疗第28天处死小鼠，取肝、脾组织研磨后提取蛋白，采用Western blot法检测Beclin1蛋白表达水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS 23.00统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验或方差分析。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 三组小鼠不同时间点体重比较 见表1。治疗后，低剂量组和高剂量组小鼠第14、28天体重都高于模型组(均P<0.05)，但低剂量组与高剂量组比较无统计学差异(均P>0.05)。

表1 三组小鼠不同时间点体重比较(g)

2.2 三组小鼠治疗后不同时间点RBC、WBC、PLT比较 见表2。治疗后，低剂量组和高剂量组治疗第14、28天RBC、WBC、PLT高于模型组(均P<0.05)，但低剂量组与高剂量组上述指标比较无统计学差异(均P>0.05)。

表2 三组小鼠治疗后不同时间点RBC、WBC、PLT比较

2.3 三组小鼠治疗后不同时间点CD45+细胞比例比较 见表3。治疗后，低剂量组和高剂量组第14、28天CD45+细胞比例低于模型组(均P<0.05)，但低剂量组与高剂量组比较无统计学差异(均P>0.05)。

2.4 三组小鼠治疗后肝、脾组织Beclin1蛋白相对表达水平比较 见表4。治疗后，低剂量组和高剂量组第28天肝、脾组织Beclin1表达水平高于模型组(均P<0.05)，但低剂量组与高剂量组比较无统计学差异(均P>0.05)。

表3 三组小鼠治疗后不同时间点CD45+细胞比例比较(%)

表4 三组小鼠治疗后肝、脾组织Beclin1蛋白相对表达水平比较

3 讨 论

MDS属于克隆性血液疾病，为比较常见的血液性恶性肿瘤，起源于恶性造血干/祖细胞[10-11]。该病患者如果伴有出血、感染等情况，容易出现病死。使用细胞系构建MDS小鼠模型是探索MDS发生、侵袭、转移等的重要手段，特别是随着NOD/SCID小鼠的发展，异种移植出现免疫排斥的概率越来越低[12]。本研究显示治疗后低剂量组和高剂量组小鼠第14、28天体重高于模型组，RBC、WBC、PLT值也高于模型组，但低剂量组与高剂量组比较无统计学差异。从机制上分析，MDS的发生、发展与DNA过度甲基化有关，胞嘧啶甲基化异常、肿瘤抑制基因转录可造成细胞异常增生并出现致癌反应，为此甲基化疗法逐渐得到认可[13-14]。低剂量地西他滨可阻滞DNA甲基转移酶并降低DNA甲基化水平，有效减缓耐药情况，进而对抑癌基因表达进行调控，减少肿瘤细胞增殖[15-16]。

MDS是一种异质性的造血干细胞疾病，其常见突变主要位于第23号外显子第882位氨基酸且突变率为15%左右的DNA甲基转移酶基因突变[17]。地西他滨是DNA甲基转移酶抑制剂，可减少DNA甲基化[18]。其可作用于增殖期细胞，使高甲基化的抑癌基因恢复为正常的去甲基状态，从而发挥抑癌功能，当前已经广泛应用于恶性肿瘤的治疗[19]。本研究显示，治疗后低剂量组和高剂量组第14、28天CD45+细胞比例低于模型组，但低剂量组与高剂量组比较无统计学差异，表明低剂量地西他滨就可抑制MDS小鼠的增殖与浸润。研究[20-21]显示，低浓度地西他滨具有使DNA甲基化丧失甲基化的作用，可促进抑癌基因表达。

MDS的主要临床特征为一系或多系血细胞减少及髓系细胞发育异常，也涉及恶性肿瘤的自噬调控表达分析[22]。Beclin1基因是重要的诱导自噬因子，主要作用于自噬启动阶段，是潜在的肿瘤抑制基因[23]。特别是恶性肿瘤细胞面临更高的代谢压力，为应对营养缺乏，需要通过抑制Beclin1的表达来维持其存活。本研究显示，治疗后低剂量组和高剂量组第28天小鼠肝、脾组织Beclin1相对表达水平高于模型组，而低剂量组与高剂量组比较无统计学差异，表明低剂量地西他滨就可提高MDS小鼠的Beclin1表达水平。

综上所述，低剂量地西他滨即可提高MDS小鼠的Beclin1表达水平，抑制增殖与浸润，从而促进小鼠外周血与体重恢复正常。但本研究也存在一定的不足，涉及的剂量组比较少，且没有进行体外实验，将在后续研究中进行探讨。