甲氟奎对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制

李静，刘芳

作者单位：枣庄矿业集团中心医院肿瘤内科，山东 枣庄 277000

食管鳞癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其占食管癌的 90% 以上，其特征是脂肪和骨骼肌质量减少、营养不良。据最新调查显示，食管鳞癌的发病率正逐年升高，尽管近期食管癌 的预后有所改善，但仍不能令人满意。因此，开发新的抗癌药物对病人具有重要的治疗价值。甲氟喹是氯喹的衍生物，是治疗疟疾的常用药物之一。甲氟奎在胶质母细胞瘤、乳腺癌中均具有抑制肿瘤进一步恶化的作用，甲氟喹的主要优点是其具有良好的剂量耐受性。于是，我们推测其对食管鳞癌的治疗可能也具有一定的疗效。β 连环素（β-catenin）是 Wnt通路中的关键核心因子，也是 β-catenin 信号通路的组成部分，其在人类的多种疾病，包括食管鳞癌中均出现活性异常升高，但其是否在甲氟奎对食管鳞癌的影响中发挥作用尚未清楚 。 本研究于2018年8月至2019年4月拟以食管鳞癌细胞KYSE140为研究对象，观察甲氟奎对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，揭示其机制与甲氟奎失活 β-catenin 信号通路有关，将为甲氟奎抗癌应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

食管鳞癌细胞 KYSE140 购自 ATCC；甲氟奎由 Unistin®韩国联合制药提供 ；DMEM 培养基、胎牛血清、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、胰蛋白酶均购自美国 Sellect 公司；Lipofectamine2000、BCA 蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自大连 Takara 公司 ；聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）购自德国罗氏诊断有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒、ECL 发光液和 RIPA 蛋白裂解液均购自碧云天生物技术公司；Matrigel 基质胶、Transwell 小室购自美国Coming 公司；凝胶成像分析仪购自柯达公司；半干转膜仪购自美国 BIO-RAD 公司；Genesys 10 紫外分光光度计购自美国 Thermo 公司；细胞培养箱购自美国 Forma Scientific 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将食管鳞癌细胞 KYSE140 用含10% 胎牛血清的 DMEM 培养基，置于 37 ℃，5% 二氧化碳的恒温培养箱中常规培养，待细胞生长至融合度 75% 左右，用胰蛋白酶消化约 1 min，按照 1∶3 的比例更换培养基，每 2 天传代 1 次。

1.2.2 细胞处理与分组 将甲氟奎（5、10、15、30 μmol∕L）用二甲基亚砜（DMSO）溶解然后用培养基稀释为 5、10、15、30 μmol∕L，分别处理 KYSE140 细胞 24、48 、72 h，标记为 5 μmol∕L 甲氟奎组、10 μmol∕L 甲氟奎组、15 μmol∕L 甲氟奎组、30 μmol∕L 甲氟奎组，筛选最适浓度和作用时间，即 15 μmol∕L 甲氟奎处理 KYSE140 细胞 48 h，标记为甲氟奎组；以 DMSO处理 KYSE140 细胞 48 h，标记为对照组 ；将 β -catenin 信号通路激活剂 Wnt3a 用 DMSO 稀释至 25 mg∕L，处理甲氟奎组细胞 24 h，标记为甲氟奎 +Wnt3a 组，其阴性对照用等量的 DMSO 处理甲氟奎组细胞 24 h，标记为甲氟奎+DMSO 组。

1.2.3 MTT 法检测细胞增殖抑制率对数期的KYSE140 细胞以 10∕mL 的密度种植于 96 孔板，按照上述“1.2.2”方法处理，分别于 24、48 和 72 h 时每孔细胞中加浓度为 5 mg∕mL MTT 溶液 20 μL，孵育 4 h，然后添加 150 μL DMSO，待结晶充分融解，在 490 nm 波长下检测细胞吸光度（A）。细胞抑制率=（1-A∕A）×100%。

1.2.4 Transwell 法检测细胞迁移和侵袭 Transwell迁移实验：将 Transwell 小室置于 24 孔板上，平衡 30 min。胰酶消化收集各组 KYSE140 细胞，用不含血清的 RPMI 1640 培养基重悬细胞，制成 5×10∕mL 的单细胞悬液。取约为 1×10个细胞加入 24 孔板各孔，于 37 ℃培养箱孵育 24 h，棉签擦去上室细胞，甲醇固定，结晶紫染液染色。晾干，于倒置显微镜下观察拍照（400 倍），计数 5 个不同视野细胞数。

Transwell 侵袭实验：将基质胶和 DMEM 培养基按 1∶8 稀释后（60 μL）铺于培养小室上，风干后备用，其他步骤同 Transwell 迁移实验。

1.2.5 蛋白质印迹法检测细胞中 β-catenin、周期素依赖激酶抑制剂 p21、增殖细胞核抗原（PCNA）、神经钙黏素（N-cadherin）、上皮钙黏素（E-cadherin）的蛋白表达 各组 KYSE140 细胞以 RIPA 裂解液于冰上裂解提取总蛋白，BCA 法对蛋白定量。并采用沸水浴致蛋白变性，目的蛋白采用 SDS-PAGE 电泳分离。湿转至 PVDF 膜，5% 脱脂奶粉封闭 1 h，4 ℃下，将封闭后的 PVDF 膜放入倍比稀释的一抗中反应过夜，洗膜，再在 37 ℃下将 PVDF 膜转入倍比稀释的二抗中反应 2 h。于暗室内 ECL 试剂盒显影曝光，以凝胶成像系统采集图像。Quantity One 4.62 图像分析软件进行条带灰度分析，以 GAPDH 为内参，计算目的蛋白的表达情况。

1.2.6 实时荧光定量逆转录聚合酶链反 应（qRTPCR）检测细胞中 β-catenin 的表达 各组 KYSE140细胞按 RNA 抽提试剂盒说明书提取 RNA，定量后使用逆转录 试 剂盒合 成 互补 DNA（cDNA）。按 qRTPCR 试剂盒说明书操作检测 miR-550a 表达量。以甘油醛 -3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，用 ΔΔCt=(Ct－Ct)－ (Ct－Ct)计算 β-catenin的表达 。 引物信息 ：β -catenin，正向引物 5'-CGCTTCTCGGCTTGCT-3′，反向引物 5'-TCCTCCCTCACAGACTCAT-3′；GAPDH，正向引物 5'-TCCCTCAAGATTGCTAGCAA-3 ′，反向引物 5'-AGATCCACAACGGATACATT-3'。

2 结果

2.1 甲氟奎对食管鳞癌细胞的抑制作用

结果如表1 所示，与对照组相比，5 μmol∕L 甲氟奎组 、10 μmol∕L 甲氟奎组、15 μmol∕L 甲氟奎组、30 μmol∕L 甲氟奎组细胞的增殖均显著降低；与 5 μmol∕L 甲氟奎组相比，10 μmol∕L 甲氟奎组、15 μmol∕L 甲氟奎组、30 μmol∕L 甲氟奎组细胞的增殖均显著降低；与 10 μmol∕L 甲氟奎组相比 ，15 μmol∕L 甲氟奎组 、30 μmol∕L 甲氟奎组细胞的增殖均显著降低（

P

＜0.05）。可见，甲氟奎可呈浓度依赖性抑制食管鳞癌细胞的增殖，且最适浓度为 15 μmol∕L，故选用该浓度用于后续试验。

表1 甲氟奎对食管鳞癌细胞增殖的影响

2.2 甲氟奎对食管鳞癌细胞迁移和侵袭的抑制作用

Transwell 实验检测细胞迁移和侵袭，对照组迁移 和 侵袭细 胞 数分别为（120±8）个、（80±6）个，甲氟奎组迁移和侵袭细胞数分别为（62±5）个、（45±4）个，与对照组相比，甲氟奎组细胞的迁移细胞数显著降低，侵袭细胞数显著降低（

t

=15.059、11.889，

P

＜0.05）。

2.3 甲氟奎对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达的影响

结果如图1 和表2 所示，与对照组相比 ，甲氟奎组细胞中 p21、E-cadherin 蛋白表达显著升高，PCNA、N-cadherin 蛋白表达显著降低（

P

＜0.05）。

2.4 甲氟奎对食管鳞癌细胞中 β-catenin 信号通路的影响

qRT-PCR 法检测细胞中 β-catenin 的表达，结果如图2 所示，对照组 β-catenin mRNA 和蛋白表达水平分别为（1.00±0.04）、（1.01±0.07），甲氟奎组β -catenin mRNA 和蛋白表达水平分别为（0.51±0.05）、（0.34±0.03），与对照组相比，甲氟奎组细胞中β -catenin 的 mRNA 和蛋白表达均显著降低（

t

=18.745、21.550，

P

＜0.05）。

2.5 激活 β-catenin 信号通路逆转了甲氟奎对食管鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭的调控

结果如图3、表3，表4 所示 ，与甲氟奎 +DMSO 组 相比 ，甲氟奎 +Wnt3a 组细胞中 β-catenin 蛋白表达显著升高，细胞的增殖显著升高，迁移细胞数和侵袭细胞数均显著升高 ，细胞中 p21、E-cadherin 蛋白表达显著降低 ，PCNA、N-cadherin 蛋白表达显著升高（

P

＜0.05）。

图1 甲氟奎处理的食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达

表2 甲氟奎对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达的影响

图2 甲氟奎处理的食管鳞癌细胞中 β-catenin 信号通路关键蛋白的表达

图3 食管癌细胞中的 β-catenin 信号通路增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达

表3 甲氟奎对食管鳞癌细胞增殖的影响∕

3 讨论

尽管医学技术不断发展，食管鳞癌的发病率和病死率仍然很高，因此，寻找高效、低毒的肿瘤治疗药物仍然十分重要。甲氟奎在临床上对耐氯奎恶性疟疾的治疗效果较好，除此之外其在人类的多种肿瘤中也具有抗癌的功效，但是其在食管鳞癌中的功能及机制研究甚少。Xu 等研究报道，甲氟奎可通过阻断结直肠癌细胞中 NF-κB 信号传导抑制结直肠癌细胞的生长，促进其凋亡，这说明抗疟疾药甲氟奎可单独作为抗癌药在结直肠癌中应用。Xie 等在食管鳞癌的研究中发现，甲氟奎处理食管鳞癌后，线粒体呼吸链中的必需酶 SDHC、SDHD、MTCO3 和 NDUFV3 的表达均显著下调，并通过电镜观察到细胞发生自噬，揭示甲氟奎可通过诱导线粒体发生自噬来抑制食管鳞癌细胞的增殖和异种移植小鼠体内肿瘤的生长。本研究通过 MTT 法、Transwell 小室检测了甲氟奎处理的食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭发现，甲氟奎可抑制食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其在食管鳞癌中发挥抑制癌症进一步恶化的作用，这与 Xie 的研究结果相呼应，再次验证了甲氟奎的抑癌功能，为甲氟奎在癌症中的应用提供理论依据。我们又通过 qRT-PCR 法、蛋白质印迹法检测了甲氟奎处理的食管鳞癌细胞中β-catenin 信号通路关键因子 β-catenin 的表达发现，甲氟奎可明显的抑制食管鳞癌细胞中 β-catenin 的表达，失活 β-catenin 信号通路的活性。Li 等在肝癌的研究中报道，甲氟奎可抑制小鼠体内肝肿瘤的生长，其机制与抑制 β-catenin 信号通路的活性相关。我们推测甲氟奎在食管鳞癌中的功能可能与β -catenin 信号通路的活化程度也具有一定的相关性。

表4 激活 β-catenin 信号通路对甲氟奎调控食管鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响∕

β-catenin 信号通路涉及肿瘤的免疫逃避、免疫抑制、免疫监视。 Wnt 信号传导过程中最重要的是 β-catenin 的稳定，导致其核转位和转录因子的激活。大部分肿瘤在 Wnt ∕β-catenin 信号通路的关键调节因子中发生突变。大量研究证实，β-catenin信号通路在食管癌的恶性化进展中具有重要 作用。本研究检测了甲氟奎处理的食管鳞癌细胞中 β-catenin 的表达发现，甲氟奎可抑制食管鳞癌细胞中 β-catenin 信号通路的活性，这说明甲氟奎可抑制 β-catenin 信号通路的活性在食管鳞癌中发挥抗癌功能；进一步研究通过 β-catenin 信号通路激活剂和 甲氟奎联合处理食管鳞癌细胞发现 ，激活 β -catenin 信号通路可逆转甲氟奎对食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭抑制作用，这更充分的说明不仅甲氟奎可抑制 β-catenin 信号通路的活性，相反，激活 β-catenin 信号通路也可逆转甲氟奎对食管鳞癌的抗癌功能。这些实验结果为甲氟奎在食管鳞癌的治疗中的应用价值提供了充分的理论参考，不足的是，我们没有在动物体内对甲氟奎的功能机制进行验证，这也是本课题下一步的研究计划。

综上所述，甲氟奎可抑制食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制与失活 β-catenin 信号通路密切相关，为甲氟奎作为抗癌药物治疗食管鳞癌提供理论参考。