肝豆汤通过肝激酶 B1/AMP 活化蛋白激酶途径改善高脂摄入引起的小鼠肝脏脂肪变性

董璐 ，刘皎皎 ，何瑾瑜 ，李瀚旻

作者单位：1 陕西省中医医院肝病科，陕西 西安 710003；2 湖北中医药大学中医临床学院，湖北 武汉 430061

肝脏脂肪变性是一种世界范围内流行的慢性病，近年来已成为一种新的健康威胁。流行病学调查表明，肝脏脂肪变性是引起非酒精性脂肪肝发病的主要因素，多由于摄入高脂饮食或脂肪代谢紊乱导致脂肪在肝脏中异常积累所致。因此主要治疗策略包括生活方式调整和改善脂质稳态的药物治疗，然而，现有药物存在较大的副作用，如体质量增加或长期使用导致死亡率增高等。因此，寻找新药物对早期诊断和精确干预具有重要意义。近年来研究发现中药肝豆汤可治疗肝脏铜代谢异常结所致的 Wilson 病。然而目前肝豆汤对肝脏脂肪变性的相关研究报道较少，本研究自 2018年 3—12月以高脂摄入为诱导肝脏脂肪变性，并以东宝肝泰为阳性对照，探究肝豆汤对高脂摄入引起的小鼠肝脏脂肪变性的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

5～6周龄健康 C57BL∕6 小鼠 60 只，SPF 级，雌雄各半，体质量范围为 18～20 g，湿度为（49±6）%，购自上海邦耀生物公司，许可证号：SCXK（沪）-2015-0002。所有实验动物均常规饲养，在 12 h 光照 12 h 黑暗条件下自由饮水，饮食，适应 1周后进行实验。

1.2 主要试剂与仪器

东宝肝泰冲剂（批号H22024764，批次 20070608）购于通化东宝药业股份有限公司，高脂饲料（货号 D12492）协同生物有限公司，肝豆汤包括大黄、黄连、姜黄、泽泻、金钱草、三七等 6 味药材，购于安徽合肥市同仁堂大药房，丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（货号 MAK052）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（货号 MAK055）购于美国 Sigma 公司，RIPA 裂解液（货号 R0020）购于北京索莱宝生物科技有限公司，兔抗 LKB1 单克隆抗体（货号 3050）、磷酸化兔抗 LKB1 单克隆抗体（货号3055）、兔抗 AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）多克隆抗体（货号 9158）、磷酸化兔抗 AMPK 多克隆抗体（货号）均购于美国 Cell Signaling Technology，兔抗尼曼匹克 C1 型类似蛋白（Niemann-Pick C1-Like 1，NPC1L1）单克隆抗体（货号 ab124801）、兔抗 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原 酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase，HMGCR）单克隆抗体 、兔抗乙酰辅酶羧化酶（Acetyl coenzyme A carboxylase，ACC）单克隆抗体（货号 ab68191）、兔抗固醇调节元件结合蛋白 1（Sterol regulatory element-binding protein，SREBP1）多 克隆抗体（货号 ab3259）均购于美国 abcam 公司。酶标仪（型号 TECAN spark）购于上海帝肯贸易有限公司 ，蛋白电泳仪（型号 1659001）购于美国 Bio-Rad公司。

1.3 模型建立与给药

参考文献［6］造模，具体步骤为：小鼠按随机数字表法分为两组，正常饮食组（10 只）和高脂饮食组（50 只），正常饮食组每日饲喂基础饲料，高脂饮食组每日饲喂高脂饲料，小鼠自由摄食及饮水，喂养 8周后构建高脂饮食模型小鼠。将 50 只高脂饮食模型小鼠，按随机数字表法分组：模型组，东宝肝泰组，肝豆汤低、中、高剂量组，每组10 只，根据文献［7］及预实验结果进行给药：东宝肝泰组、肝豆汤低、中、高剂量组分别给东宝肝泰冲剂0.225 g∕kg、肝豆汤（22，44，66 g∕kg）各 2 mL·kg·d处理，同时正常饮食组和模型组各灌胃给予生理盐水 2 mL·kg·d，每日 1 次，连续给药 6周 后，禁食24 h 后用于后续实验，给药期间正常组小鼠饲喂基础饲料，其余各组饲养高脂饲料养。

1.4 组织样品采集

对“1.3”中各组小鼠颈椎脱臼法处死后立即眼球取血并置于离心管中，4 ℃冷凝过夜后，取上清于 4 ℃，12 000 r∕min 离心 15 min，取血清置于-20 ℃保存备用。取出各组小鼠肝脏，用预冷的生理盐水冲洗至无血丝，滤纸擦干，一部分用 4% 多聚甲醛固定 ，另一部分置于- 80 ℃ 保 存备用。

1.5 肝组织形态学分析

取“1.4”中 4% 多聚甲醛固定的肝脏组织，在肝左叶中部横切面取材，脱水后石蜡包埋，用切片机制成厚度 5 μm 的切片，并进行 HE 染色，显微镜观察染色结果。取出保存在-80 ℃的肝脏组织，制成厚度 5 μm 的冰冻切片，采用油红 O 染色，镜下观察。

1.6 肝脏组织中总胆固醇、三酰甘油含量测定

取“1.4”中肝脏组织 200 mg，加入氯仿∶甲醇（2∶1）萃取液 2 mL，匀浆器研磨制备匀浆，4 ℃，12 000 r∕min 离心 10 min。取上清液，按照试剂盒说明书对各组小鼠肝脏组织中总胆固醇、三酰甘油含量测定。

1.7 各组小鼠血清中 AST、ALT 活性测定

取出“1.4”中保存的血清，按照 AST、ALT 检测试剂盒说明书，对各组小鼠血清中 AST、ALT 含量检测。

1.8 蛋白质印迹法（Western blotting）各组小鼠肝脏组 织中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPK、AMPK、ACC、p-ACC 蛋白相对表达

取“1.4”中冻存的每组小鼠的肝脏组织，加入含 PMSF 的 RIPA 裂解液，在匀浆器中破碎，离心，提取蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白的浓度，按照 4∶1 在蛋白中加 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴加热 3～5 min，放于-20 ℃保存。严格按照十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）配方表制 备 8%、10% 分离胶和 5%浓缩胶，上样量 30 μg，上样后进行蛋白凝胶电泳，根据蛋白 marker 切胶 ，转膜 ，加入抗体 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPK、AMPK、ACC、p-ACC（均 1∶500 稀释）孵育，放置 4 ℃过夜，等渗缓冲盐溶液（TBST）清洗，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育 1 h，TBST 清洗后，采用 ECL发光液对条带孵育后，曝光、显影，Image J 对条带灰度值分析。

2 结果

2.1 小鼠肝脏组织形态学变化

与正常组小鼠肝组织相比，模型组出现脂肪变性，肝细胞肿大，细胞质内含有大量脂肪滴空泡，且橘红色的脂肪滴增多，红染区域颜色较深；与模型组相比，肝豆汤低、中、高剂量组小鼠肝细胞肿大依次减轻，细胞质中脂肪滴空泡依次减少，且橘红色的脂肪滴数量依次减少，东宝肝泰组小鼠肝细胞肿大减轻，细胞质中脂肪滴空泡减少，且橘红色的脂肪滴数量减少，其中肝豆汤中剂量组与东宝肝泰组比较，无明显变化。见图1，2。

图1 各组小鼠肝脏组织显微镜图片（HE染色×200）：A为正常组；B为模型组；C为东宝肝泰组；D为肝豆汤低剂量组；E为肝豆汤中剂量组；F为肝豆汤高剂量组 图2 各组小鼠肝脏组织显微镜图片（油红O染色×200）：A为正常组；B为模型组；C为东宝肝泰组；D为肝豆汤低剂量组；E为肝豆汤中剂量组；F为肝豆汤高剂量组

2.2 肝豆汤对高脂摄入小鼠血清肝功能指标 AST，ALT 的活性影响

与正常组相比，模型组小鼠血清中 AST、ALT 的 活性均升高（

P

＜0.05）；与模 型组 相比，肝豆汤低、中、高剂量组小鼠血清中 AST、ALT 的活性依次降低（

P

＜0.05），东宝肝泰组小鼠血清中AST、ALT 的活性均降低（

P

＜0.05），其中肝豆汤中剂量组与东宝肝泰组组比较，差异无统计学意义（

P

＞0.05）。见表1。

表1 各组小鼠血清肝功能指标天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）的活性的比较

2.3 肝豆汤对高脂摄入小鼠肝组织总胆固醇、三酰甘油含量的影响

与正常组相比，模型组小鼠肝组织中总胆固醇、三酰甘油含量均升高（

P

＜0.05）；与模型组相比，肝豆汤低、中、高剂量组小鼠肝组织中总胆固醇、三酰甘油含量依次降低（

P

＜0.05），东宝肝泰组小鼠肝组织中总胆固醇、三酰甘油含量均降低（

P

＜0.05），其中肝豆汤中剂量组与东宝肝泰组组比较，差异无统计学意义（

P

＞0.05）。见表2。

2.4 肝豆汤对高脂摄入小鼠肝脏组织中总胆固醇和三酰甘油合成相关蛋白的影响

与正常组相比，模型组小鼠肝组织中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相对表达量均升高（

P

＜0.05）；与模型组相比，肝豆汤低 、中 、高剂量组小鼠肝组织中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相对表达量依次降低（

P

＜0.05），东宝肝泰组小鼠肝组织中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相对表达量均降低（

P

＜0.05），其中肝豆汤中剂量组与东宝肝泰组组比较，差异无统计学意义（

P

＞0.05）。见表3。

表2 各组小鼠肝组织中总胆固醇、三酰甘油含量的比较∕（mmol∕L，）

表3 各组小鼠肝组织中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1相对表达量比较∕

2.5 肝豆汤对各组小鼠肝脏 LKB1/AMPK 通路相关蛋白表达的影响

与正常组相比，模型组小鼠肝组织中 p-AMPK、p-LKB1、p-ACC 蛋白相对表达量均降低（

P

＜0.05）；与模型组相比，肝豆汤低、中、高剂量组小鼠肝组织中 p-ACC、p-AMPK、p-LKB1 蛋白相对表达量依次升高（

P

＜0.05），东 宝肝泰组小鼠肝组织中 p-ACC、p-AMPK、p-LKB1 蛋白相对表达量均升高（

P

＜0.05），其中肝豆汤中 剂 量 组与东宝肝泰组组比较，差异无统计学意义（

P

＞0.05）。见表4。

3 讨论

随着社会发展 ，人们生活水平日益提高 ，由于高脂膳食摄入诱导的机体肥胖及代谢紊乱等相关疾病日益增多。已有研究报道高脂膳食可导致肝脂肪变性，且通过高脂饲料造模费用低，时间相对短，期间小鼠不易发生死亡，因此本实验以高脂饲料饲喂小鼠，结果发现，与正常组相比，模型组小鼠肝组织出现脂肪变性，肝细胞肿大，细胞质内含有大量脂肪滴空泡，且橘红色的脂肪滴增多，红染区域颜色较深，提示高脂摄入可引起小鼠肝脏脂肪变性，脂肪空泡增多。

表4 各组小鼠肝组织中 p-AMPK、p-LKB1、p-ACC相对表达量比较∕

研究发现中药具有多层次、多靶点、不良反应少等特点，在防治肝脏疾病中应用越来越广泛。耿昊等在对肝豆状核变性研究发现，肝豆汤可促进损伤区的肝组织代偿性自愈，促进铜的排出从而减轻高铜所致肝脏组织损伤。本研究发现，与模型组相比，肝豆汤低、中、高剂量组小鼠肝细胞肿大依次减轻，脂肪滴空泡依次减少，提示肝豆汤可剂量依赖地减少高脂饮食小鼠肝组织中脂肪脂滴数量，减少脂肪积累，且中剂量肝豆汤组与东宝肝泰药效一致。肝脏中含有多种酶类，肝脏损伤可引起血清中多种酶活性发生改变，其中 AST、ALT 是临床常用肝功能评价指标。 此外肝脏脂肪积累与肝脏中总胆固醇、三酰甘油含量相关。总胆固醇、三酰甘油与低密度脂蛋白结合后，可被排出肝细胞，当该过程发生障碍时，大量总胆固醇、三酰甘油在肝脏中堆积，引起肝脏脂肪变性。本研究发现，与正常组相比，模型组小鼠血清中 AST、ALT 的活性及肝组织中总胆固醇、三酰甘油含量均升高，与模型组相比，肝豆汤低、中、高剂量组小鼠血清中 AST、ALT 的活性及肝组织中总胆固醇、三酰甘油的含量依次降低，且中剂量肝豆汤与东宝肝泰组效果接近，肝豆汤高剂量效果最优，提示肝豆汤可降低高脂饮食诱导的小鼠肝组织中总胆固醇、三酰甘油含量，减轻肝功能损伤。

研究发现调控核转录的激活因子 SREBP 可直接激活总胆固醇、三酰甘油合成相关基因及调节还原型辅酶Ⅱ（NADPH）表达。SREBP-1 可调节总胆固醇合成途径中限速酶 HMGCR 基因表达，调控总胆固醇合成，进而调节机体内脂质代谢平衡，同时 SREBP-1 与总胆固醇、三酰甘油合成相关基因表达密切相关。此外 NPC1L1 作为一种固醇转运体，位于肠上皮细胞的顶端膜和肝 细胞的小管膜上 ，可介导肠道总胆固醇吸收和肝总胆固醇排泄。研究发现，NPC1L1 缺乏可降低肝组组中总胆固醇含量，还可预防饮食诱导的肝脂肪变性和肥胖。本研究发现，与正常组相比，模型组小鼠肝组织中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相对表达量均升高；与模型组相比，肝豆汤低、中、高剂量组小鼠肝组织中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相对表达量依次降低，其中肝豆汤中剂量组小鼠肝组织中HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相对表达量与东宝肝泰组比较，差异无统计学意义。提示肝豆汤可能通过下调 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白表达，调节高脂饮食小鼠肝组织中总胆固醇、三酰甘油合成代谢，影响脂肪合成，以高剂量肝豆汤效果最显著。

近年 LKB1-AMPK 信号途径在脂代谢过程中作用成为研究热点，LKB1 作为 AMPK 的上游激酶，其磷酸化可激活 AMPK，活化的 AMPK 可通过进一步催化 ACC 磷酸化，进而抑制三酰甘油、总胆固醇合成，调节脂质代谢平衡；另外活化的 AMPK 还可促使HMGR 磷酸化，进而抑制总胆固醇合成，同时促进三酰甘油、总胆固醇水解。研究报道印度东北部发酵大豆提取物可通过调节 AMPK∕sREBP∕PPARα信号通路，减轻肝脂肪变性，此外还有报道厚朴酚可通过激活 AMPK，抑制 SREBP-1 c 和成脂基因表达，从而减轻肝脏脂肪堆积和肝细胞损伤。本研究发现 ，与正常组相比，模型组小鼠肝组织中 p-AMPK、p-LKB1、p-ACC 蛋白相对表达量均降低；与模型组相比，肝豆汤低、中、高剂量组小鼠肝组织中p-ACC、p-AMPK、p-LKB1 蛋白相对表达量依次升高，提示肝豆汤可能通过激活 LKB1-AMPK 信号途径，下调 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白表达，进而减轻肝脏脂肪变性。

综上所述，肝豆汤可减轻高脂摄入引起的小鼠肝脏脂肪变性、保护肝功能，可能通过激活 LKB1-AMPK 信号途径 ，下调 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1蛋白表达，降低肝脏总胆固醇、三酰甘油含量实现。而本研究还存在一定局限性，肝豆汤改善高脂摄入所致肝脏脂肪变性的具体机制尚需进一步深入探究。