人参皂苷 Rg5 通过抑制蛋白激酶 B 信号通路调控肝癌 HepG2细胞生物学行为

郭慧，刘鹏飞

作者单位：湖南中医药高等专科学校附属第一医院药学部，湖南 株洲 412000

肝癌是肿瘤相关性死亡的重要原因之一，我国是肝癌的高发区，每年有 11～13 万人死于肝癌，占全球肝癌死亡的 50% 以上；目前以手术切除为主的综合治疗是肝癌的主要治疗手段，但其治疗效果并不理想。人参皂苷是中药材人参的主要活性成分之一，具有提高免疫、抗病毒、抗炎和抗肿瘤等广泛的药理作用；人参皂 苷 Rg5 是稀有人参 皂苷之一，可 通过影响肿瘤细胞增殖和凋 亡等抑制宫颈癌、乳腺癌和胃癌等多种肿瘤细胞的生长，但其对肝癌细胞生长的影响并不清楚。因此，本研究通过常规生物学手段观察人参皂苷 Rg5 对肝癌 HepG2细胞增殖、侵袭、迁移、周期和凋亡的影响，并探讨其可能的分子机制，以揭示其对肝癌细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人参皂苷 Rg5（纯度 98%）购于维克奇生物科技公司，洛斯维公园纪念所 1640 培养基（RPMI1640）、胎牛血清、青霉素链霉素双抗和胰蛋白酶购于美国 Gibco 公司，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）试剂和二甲基亚砜购于美国 Sigma 公司，RIPA 细胞裂解液购于上海碧云天公司，兔抗蛋白激酶 B（AKT）、磷酸化蛋白激酶 B（p-AKT）、B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、基质金属蛋白酶 9（MMP-9）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体购于美国 CST 公司，鼠抗细胞周期蛋白 D1（cyclin D1）单克隆抗体购于美国 Santa Cruz 公司，辣根过氧化酶标记的羊抗兔或鼠 IgG 抗体购于北京中杉金桥生物公司，细胞周期检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒、Braford 蛋白含量检测试剂盒和电化学发光法（ECL）检测试剂盒均购于南京凯基生物公司。

1.2 细胞培养

将来自中科院上海细胞库的肝癌HepG2 细胞解冻复苏后，接种于含 100 U∕mL 青霉素链霉素双抗和10% 胎牛血清的RPMI1640 培 养 基中，并在温度为 37 ℃、湿度饱和、体积分数为 5% 二氧化碳的细胞培养箱内常规培养。每 2 天更换一次细胞液，定期观察。待细胞铺满瓶底 85% 时，加入0.25% 胰蛋白酶消化，并按照 1∶3 比例传代。实验所用细胞为生长状况良好的第3代对数生长期细胞。

1.3 细胞增殖实验

将对数生长期的 HepG2 细胞以每孔 2×10个细胞种植于 96 孔细胞板上，置于细胞培养箱中常规培养过夜。以 RPMI1640 培养基将人参皂苷 Rg5 的浓度调整为 10、20、40、80 和 160 μmol∕L。次日，弃细胞培养液后，加入终浓度为 10、20、40、80 和 160 μmol∕L 人参皂苷 Rg5，并以不含人参皂苷 Rg5 的细胞作为对照（0 μmol∕L）组，另设置不含细胞的培养液作为空白对照组，每组设置 3 个复孔。分别在细胞培养箱内培养 24、48 和 72 h 后，每孔加入 20 μL 浓度为 5 mg∕mL 的 MTT 溶液，于细胞培养箱内培养 4 h 后，加入 100 μL 二甲基亚砜震荡反应至 MTT 结晶完全溶解。采用酶标仪检测各处理组细胞的吸光度（OD）值，并以（药物组 OD-空白组 OD）∕（对照组 OD-空白组 OD）×100% 的值表示各组细胞的存活率。实验重复 3 次。

1.4 细胞侵袭和迁移实验

将对数生长期 的HepG2 细胞以每孔 100 μL（浓度 10个∕毫升）接种于24 孔细胞板上，于细胞培养箱中常规培养过夜后，加入终浓度为 0、40、80 和 160 μmol∕L 人参皂苷 Rg5，每组设置 3 个重复。继续培养 24 h 后，胰蛋白酶消化收集各组细胞，并制成浓度为 10个∕毫升细胞悬液。 侵袭实验：首先 ，以 50 μL Matrigel 溶液包被Transwell 小室的聚碳酸酯微孔膜，并在室温下充分融合凝固（迁移实验中无需该步骤）。在小室下层加入 600 μL 含血清培养基，上层中加入制备的细胞悬液 100 μL。在细胞培养箱中培养 48 h 后，取出小室。拭去上层内残留的细胞，分别以甲醛固定、结晶紫染色 15 min。洗去染色液后，自然晾干，在倒置显微镜下随机选取 3 个视野统计穿过滤膜的细胞数（即侵袭细胞数）。迁移实验：除了不需对 Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜进行包被外，其余步骤与侵袭实验的步骤相同。实验重复 3 次。

1.5 细胞周期和凋亡实验

将对数生长期 的HepG2 细胞以每孔 2×10个细胞接种至 6 孔细胞板上，于培养箱内培养过夜。加入终浓度为 0、40、80和 160 μmol∕L 人参皂苷 Rg5，每组设置 3 个复孔，培养箱内处理 48 h 后，以胰蛋白酶消化收集各处理组细胞，并将其分为两份，一份用以细胞周期检测，一份用以细胞凋亡检测。具体操作步骤参照细胞周期检测试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒说明书。实验重复 3 次。

1.6 AKT 信号通路相关蛋白表达实验

将对数生长期的 HepG2 细胞以每孔 2×10个细胞接种至 6 孔细胞板上，孵育过夜后，加入终浓度为 0、40、80 和160 mol∕L 人参皂苷 Rg5，每孔设置 3 次复孔。孵育48 h 后，胰蛋白酶消化收集各组细胞，磷酸缓冲液洗涤细胞后，1 200 r∕min 低温离心 5 min，弃上清，加入RIPA 细胞裂解液冰上裂解提取总蛋白，并以 Braford法检测总蛋白的浓度。在蛋白样品中加入上样缓冲液，混匀后，置于沸水浴中变性 5 min。在 SDSPAGE 凝胶孔中，加入各处理组蛋白样品，40 mA 恒流电泳 2 h。以湿转法将蛋白样品转至 PVDF 膜上后，浸泡于含 5% 脱脂奶粉的封闭液中封闭 1 h。以一抗工作液（AKT 1∶1 000、p-AKT 1∶1 000、cyclin D1 1∶500、MMP-9 1∶800、Bcl-2 1∶1 000 和 GAPDH 1∶1 000）4 ℃孵育过夜后，置于二抗工作液（1∶2 000）中室温孵育 1 h。 经 ECL 发光液显影曝光后 ，以GAPDH 为内参，采用凝胶成像系统分析各组细胞中目的蛋白的表达水平。实验重复 3 次。

2 结果

2.1 人参皂苷 Rg5 对肝癌 HepG2 细 胞增殖的影响

在 24 h 作用时间下，40、80 和 160 μmol∕L 人参皂苷 Rg5 的细胞存活率较对照（0 μmol∕L）组明显降低（

P

＜0.05）；在 48 h 作用时间下，20、40、80 和 160 μmol∕L 人参皂苷 Rg5 的细胞存活率均显著低于对照（0 μmol∕L）组（

P

＜0.05）；而在 72 h 作用时间下，不同浓度的人参皂苷均可使 HepG2 细胞存活率低于 0 μmol∕L 组（

P

＜0.05）。计算得出，人参皂苷 Rg5 作用HepG2 细胞 24、48 和 72 h 后的半数抑制浓度（IC）值分别为 138.60、91.12 和 46.92 μmol∕L。故后续选用 40、80 和 160 μmol∕L 的人参皂苷 Rg5 进行实验。见表1。

2.2 人参皂苷 Rg5 对肝癌 HepG2 细胞侵袭、迁移的影响

与对照（0 μmol∕L）组相 比 ，40、80 和 160 μmol∕L 处理组中侵袭细胞数和迁移细胞数均明显降低（

P

＜0.05）；且 80 和 160 μmol∕L 处理组显著低于40 μmol∕L 处理组（

P

＜0.05）；但 160 μmol∕L 处理组与80 μmol∕L 处理组相比，侵袭和迁移细胞数差异无统计学意义（

P

＞0.05）。见图1、表2。

表1 不同浓度人参皂苷 Rg5 处理后各组肝癌 HepG2 细胞的存活率∕（%，）

表2 各组肝癌 HepG2 细胞中侵袭细胞数和迁移细胞数∕（个，）

2.3 人参皂苷 Rg5 对肝癌 HepG2 细胞周期的影响

人 参皂苷 Rg5 处 理后 HepG2 细胞在 G2∕M 期 的百分比与对照（0 μmol∕L）组相比，差异无统计学意义（

P

＞0.05）。与对照（0 μmol∕L）组相比，40、80 和160 μmol∕L 人参皂苷 Rg5 可使 HepG2 细胞在 G0∕G1期的百分比明显升高（

P

＜0.05），而在 S 期的百分比明显降低（

P

＜0.05）；且 80 和 160 μmol∕L 人参皂苷Rg5 引起的细胞周期分布的变化明显大于 40 μmol∕L（

P

＜0.05），但 80 μmol∕L 和 160 μmol∕L 处理组之间差异无统计学意义（

P

＞0.05）。见表3。

表3 各组肝癌 HepG2 细胞的周期分布和凋亡率∕（%，）

2.4 人参皂苷 Rg5 对肝癌 HepG2 细胞凋亡的影响

与对照（0 μmol∕L）组相比，不同浓度的人参皂苷 Rg5 处理后 HepG2 细胞凋亡率均明显升高（

P

＜0.05）；且 80 和 160 μmol∕L 处理组细胞凋亡率明显高于 40 μmol∕L 处理组（

P

＜0.05）；但是，160 μmol∕L 处理组细胞凋亡率与 80 μmol∕L 处理组相比，差异无统计学意义（

P

＞0.05）。见图2、表3。

图1 不同浓度人参皂苷Rg5对肝癌HepG2细胞侵袭、迁移的影响（结晶紫染色×400）：A为Transwell检测侵袭实验结果；B为Transwell检测迁移实验结果 图2 流式细胞仪检测不同浓度人参皂苷Rg5处理后各组肝癌HepG2细胞的凋亡情况

2.5 人参皂苷 Rg5 对肝癌细胞中 AKT、p-AKT、cy-

clin D1、MMP-9 和 Bcl-2 蛋白表达的影响

与对照（0 μmol∕L）组相比，人参皂苷 Rg5 处理后 HepG2 细胞中 AKT 蛋白的表达水平差异无统计学意义（

P

＞0.05），但 40、80 和 160 μmol∕L 处理组细胞中 p-AKT、cyclin D1、MMP-9 和 Bcl-2 的表达水平较对照（0 μmol∕L）组均明显降低（

P

＜0.05），且高浓度 80 和 160 μmol∕L 的作用强度明显大于低浓度 40 μmol∕L（

P

＜0.05）；而 160 μmol∕L 和 80 μmol∕L 的作用效果差异无统计学意义（

P

＞0.05）。见图3、表4。

图3 蛋白质印迹法检测不同浓度人参皂苷 Rg5 处理的肝癌 HepG2细胞 AKT 信号通路相关蛋白的表达

表4 各组肝癌 HepG2 细胞中 AKT 信号通路相关蛋白的表达情况

3 结论

人参是我国传统的中药材之一，含有丰富的皂苷类成分，其中人参皂苷 Rg3 已被作为肿瘤新生血管抑制剂批准上市，而人参皂苷 Rg5 在肿瘤中的研究还处在实验阶段。有学者在肺癌中发现，人参皂苷 Rg5 具有一定的抗癌活性，可通过调控与凋亡相关的钙调素样蛋白、嘌呤核苷磷酸化酶、转醛酶、胆绿素还原酶、醛脱氢酶、二氢蝶啶还原酶和活性反应 DNA 结合蛋白-43 的表达诱导癌细胞凋亡。Cui 等在视网膜母细胞瘤中发现，人参皂苷 Rg5 通过灭活 AKT 信号通路，抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，并下调 Bcl-2 的表达。有研究在乳腺癌中发现，人参皂苷 Rg5 可通过下调周期相关蛋白 cyclin D1、CyclinE2、周期素依赖性激酶 4（CDK4）和上调p21、p53 等的表达诱导细胞周期阻滞于 G0∕G1，抑制癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。此外，李为等在胃癌中指出，人参皂苷 Rg5 可通过调控 miR-125b 表达抑制癌细胞侵袭和迁移。本研究以不同浓度的人参皂苷 Rg5 作用于肝癌 HepG2 细胞不同时间后发现，人参皂苷 Rg5 可呈时间-剂量依赖性抑制 HepG2细胞增殖；此外，还发现人参皂苷 Rg5 可诱导 HepG2细胞周期阻滞于 G0∕G1 期，抑制 HepG2 细胞侵袭、迁移并促进细胞凋亡。该结果与人参皂苷 Rg5 在乳腺癌、胃癌中的抗肿瘤作用相吻合。这提示人参皂苷 Rg5 可通过抑制肝癌细胞增殖、侵袭、迁移和促进细胞凋亡发挥抗肝癌的作用。

磷脂酰肌醇-3-羟激酶（PI3K）∕AKT 信号通路是细胞内重要的信号转导途径，AKT 是 PI3K 下游的调节分子，活化的 AKT 以磷酸化形式存在，可通过影响下游转移相关基因 MMP-9、凋亡相关基因 Bcl-2、增殖相关基因 cyclin D1 等的表达，在调控细胞增殖、转移和凋亡过程在发挥着重要作用，其过度活化与包括肝癌在内的多种肿瘤的发生发展密切相关。Liu 等和 Zhang 等分别在乳腺癌和食管癌中证实人参皂苷 Rg5 可通过抑制 AKT 信号通路的活化发挥抗肿瘤作用。为了进一步探讨人参皂苷 Rg5 抗肝癌的分子机制，本研究采用蛋白质印迹法检测发现，人参皂苷 Rg5 可使肝癌 HepG2 细胞中AKT 信号通路相关蛋白 p-AKT、cyclin D1、MMP-9 和Bcl-2 蛋白的表达水平明显降低。这提示，人参皂苷Rg5 可能通过抑制 AKT 信号通路活化影响肝癌HepG2 细胞增殖、转移和凋亡过程，进而发挥抗肝癌的作用。

综上所述，人参皂苷 Rg5 可抑制肝癌 HepG2 细胞增殖、侵袭、迁移并诱导细胞周期阻滞和凋亡，其作用机制可能与抑制 AKT 信号通路的活化有关。该结果从细胞水平上阐述了人参皂苷 Rg5 对肝癌的作用，为人参皂苷 Rg5 在肝癌方面的深入研究奠定了基础，也为肝癌的治疗提供了新的线索。