基于网络药理学及分子对接技术探讨六味地黄丸治疗胃腺癌的作用机制研究

刘亚琪 ，王逸骁 ，胡作为 ，郑承红

作者单位：1 武汉市中心医院中医科，湖北 武汉 430065；2 襄阳市中医医院内科，湖北 襄阳 441000；3 湖北中医药大学中医临床医学院，湖北 武汉 430065

胃腺癌是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，被认为是全球第五大常见癌症和第三大癌症死亡原因，胃腺癌预后不佳，目前手术治疗仍是其主要治疗手段，虽然放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗改善了胃腺癌病人的预后，但晚期胃腺癌病人的中位生存期仍不超过 12 个月，由于其治疗手段的局限性，且部分病人难以耐受手术及放化疗，西医治疗带来的副反应等一系列问题，越来越多的胃腺癌病人寻求中医治疗。六味地黄丸是以“三补三泻”为特征的滋阴补肾的名方，胃腺癌病人由于手术耗气伤阴或肿瘤在体内长期消耗，或各种治疗引起正气亏损，阴血不足，最终导致胃阴不足，机体虚弱，无以耐受治疗及肿瘤的消耗。肾之气阴是一身元阴元阳的根本，滋阴补肾，从先天之本养后天消耗之气阴，培本固元，可对胃腺癌病人起到积极的效果。临床研究显示，六味地黄丸可抑制多种肿瘤细胞的活性，且可改善晚期胃癌病人生存质量 ，延长其生存期。

网络药理学是一种基于系统生物学的理论，对选取的特点信号节点（Nodes）进行的多靶点药物分子设计及分析的新学科。目前多数网络药理学研究的是单药或对药成分，很少有针对中药复方的研究，因此，本研究采用网络药理学研究方法，对六味地黄丸抗胃腺癌的主要有效成分、靶点及通路进行系统阐述，以期为后续实验及临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 药物化学成分的构建

依托中药系统药理学分析平台（TCMSP）（https：∕∕old.tcmsp-e.com∕tcmsp.php）检索六味地黄丸中（熟地黄、牡丹皮、泽泻、山茱萸、山药、茯苓）所有化学成分信息，其中熟地黄有关的化学成分 76 个，丹皮有关的化学成分 55个，泽泻有关的化学成分 46 个，山茱萸有关的化学成分 226 个，山药有关的化学成分 71 个，茯苓有关的化学成分 34 个。

1.2 口服利用度（OB）和类药性（DL）筛选

药物化学成分筛选选择 OB≥30%，DL≥0.18 作为有效成分的筛选条件，通过条件筛选，共有 69 个化学成分符合条件，其中熟地黄 2 个，牡丹皮 11 个，泽泻 10个，山茱萸 20 个，山药 16 个，茯苓 15 个，其中相同的化合物有 5 个，故共有 69 个有效成分。

1.3 药物靶点及疾病靶点的建立

通过 TCMSP 平台寻找 69 个有效成分对应的靶点。并在 Genecard（https：∕∕www.genecards.org∕）、OMIM（https：∕∕omim.org∕）、TTD（http：∕∕db.idrblab.net∕ttd∕）、Drugbank（https：∕∕www.drugbank.com∕）、DisGeNET（https：∕∕www.disgenet.org∕）数据库中检索胃腺癌相关靶点并进行整合，从而构建胃腺癌相关靶点集合。

1.4 药物靶点及疾病靶点的匹配

将筛选后的药物有效成分所对应的靶点与疾病相关靶点进行匹配 ，匹配所得靶点在 STRING 数据库（https：∕∕string-db.org∕）中建立蛋白质相互作用（PPI）网络图。同时运用 Cytoscape3.6.2（http：∕∕www.cytoscape.org∕）进行药物成分、靶点之间的网络拓扑分析。

1.5 功能富集分析与通路分析

为了说明中药有效成分对应的预测靶点在基因功能和通路中的作用 ，依托生物学信息注释数据库 Metascape（http：∕∕metascape.org），以

P

＜0.01 作为具有统计学差异的筛选条件，对获取的靶点进行基因本体（GO）富集和京都基因和基因组数据库（KEGG）通路注释分析 。 并将药物疾病靶点及 KEGG 通路导入 Cytoscape3.6.2 软件中进行分析。

1.6 分子对接

通过 pubchem 网站（https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov∕）检索获取核心化合物的3D结构，采用 AutoDock vina1.1.2 软件对 PPI 网络中度值（degree）前 5 的靶点蛋白与其原配体及核心化合物进行分子对接。通过对接分数值（docking score）对成分与靶点之间的结合活性进行评价。

1.7 统计学方法

OB（口服生物利用度）使用 TCMSP 内部软件 OBioavail 1.1 计算，OB≥30% 是确定生物活性分子作为治疗药物的指标。DL（类药性）用于评估预期化合物的“类药”程度，化合物的“类药”水平为 0.18，这是传统中草药中“类药”化合物的选择标准。KEGG 及 GO 富集过程中的

P

值是基于超几何分布计算的，以

P

＜0.01 作为差异有统计学意义的筛选条件。分子对接 AutoDock 软件评价受体和配体之间的匹配情况，结合能≤-5.0 kcal∕mol 为分子与靶点结合性较好。

2 结果

2.1 六味地黄丸有效成分

通过在 TCMSP 数据库内检索 ，获得全方中的药物化学成分共 508 个，将508 个化学成分根据 OB≥30%，DL≥0.18 的标准进行筛选后共得到 69 个有效成分，见表1。

表1 六味地黄丸有效成分列表

续表1 六味地黄丸有效成分列表

2.2 六味地黄丸作用靶点

根据 TCMSP 数据库中的有效成分靶点信息，共收集到六味地黄丸中有效成分的相关作用靶点共 506 个，其中丹皮 214 个、茯苓 23 个、山药 122 个、山茱萸 108 个、熟地 30 个和泽泻 9 个 。 从 Genecard、OMIM、TTD、Drugbank、Dis-GeNET 等数据库中检索胃腺癌相关靶点后 进行整合 ，共获得 6198 个疾病相关靶点 。 将药物相关靶点与疾病相关靶点进行对比分析，取交集可以得到156 个六味地黄丸抗胃腺癌的可能作用靶点。

2.3 PPI 网络的构建

在 STRING 数据库中构建上述 156 个靶点的蛋白质相互作用网络（PPI）。由于单独孤立的蛋白与其他蛋白无相互作用，均不在蛋白互作网络中体现，故此网络中共包含 147 个节点，1 048 条边。节点大小及颜色由 degree 的大小表示，节点越大对应的 degree 越大，颜色由红色到蓝色，对应的 degree 越大（图1）。对 PPI 进行拓扑特征分析，选取在“ 度值 ”（degree），“ 中介中心性 ”（betweenness），“ 接近中心性 ”（closeness）3 个参数均大于中位数的点作为核心靶点，连续进行 3 次筛选后，得到20 个重要核心靶点 ，具体包括 JUN（degree=48，closeness=0.857） ，MAPK1 （degree=52，closeness=0.837），IL-6（degree=52，closeness=0.800），AKT1（degree=64，closeness=0.783），MAPK8（degree=53，closeness=0.783），VEGFA（degree=43，closeness=0.766），MYC（degree=40，closeness=0.735），ESR1（degree=33，closeness= 0.692），EGF（degree=39，closeness=0.692），HSP90AA1（degree=42，closeness=0.679），RELA（degree=34，closeness=0.679），FOS （degree=29，closeness=0.667），EGFR（degree=35，closeness=0.667），CCND1（degree=37，closeness=0.667），AR（degree=29，closeness=0.667），MMP9（degree=35，closeness=0.667） ， STAT1 （degree=29， closeness=0.667），IL1B（degree=35，closeness=0.655），PPARG（degree=25，closeness=0.655），PTGS2（degree=32，closeness=0.655）。基于 20 个重要核心靶点，根据相关有效成分，进一步构建药物有效成分-核心靶点网络 ，通 过 Cytoscape 网络图分析可以发现 ：丹皮通过quercetin（MOL000098）、kaempferol（MOL000422）、5-［［5-（4-Methoxyphenyl）-2-furyl］methylene］barbituric acid（MOL007374）作用于 20 个核心靶点发挥作用 ，山药通过 diosgenin（MOL000546）、AIDS180907（MOL005465）、（-）-taxifolin（MOL001736）、Kadsurenone（MOL000322）、Stigmasterol（MOL000449）对PTGS2、RELA、VEGFA、AKT1、ESR1、HSP90AA1、AR 核心靶点发挥作用，山茱萸通过 Tetrahydroalstonine（MOL008457）、beta-sitosterol（MOL000358）、Hydroxygenkwanin （MOL005530） 、 Mandenol（MOL001494）、Cornudentanone（MOL005503）、2，6，10，14，18-pentamethylicosa-2，6，10，14，18-pentaene（MOL005481）对 AR、HSP90AA1、PPAGR、PTGS2、JUN 等核心靶点发挥作用 ，茯苓和熟地分别通过hederagenin （MOL000296） 及 Stigmasterol（MOL000449）对 PTGS2 发挥作用 。 这些药物有效成分及靶点的相互作用，体现了六味地黄丸多成分多靶点抗胃腺癌的作用关系。见图2。

2.4 GO 富集分析

将六味地黄丸活性成分预测出的 156 个作用靶点通过 Metascape 生物分子功能注释系统进行 GO 富集分析 ，包括 GO BP 生物过程分析（biological process）、GO MF 分子功能（molecular function）分析 和 GO CC 细胞组分分析（cellular component）。在其中每项排名前 10 的条目，见表2。

其中 GO BP 中 response to inorganic substance，response to toxic substance，cytokine-mediated signaling pathway 靶点富集较集中 ；GO MF 中 protein kinase binding，transcription factor binding，protein domain specific binding 靶点相对集中富集；在 GO CC中与 membrane raft，transcription factor complex，perinuclear region of cytoplasm 相关性最大。

2.5 KEGG 通路富集分析

为了进一步揭示六味地黄丸抗胃腺癌的潜在作用机制，通过对 156 个候选靶点进行 KEGG 通路富集分析，依据

P

＜0.01 进行筛选共获得 36 条相关通路，涉及肿瘤、代谢、免疫、信号转导、细胞凋亡等多个方面，将 36 个通路根据 P值由小到大进行排序 。 排在前5位的依次是hsa05200：Pathways in cancer 信号通路、hsa04933：晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体（AGERAGE） in diabetic complications 信号通路 、hsa04668：肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、hsa04066：缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路 、hsa01524：Platinum drug resistance 信号通路，将获得的靶点及前 20项信号通路导入 Cytoscape 3.6.2 进行分析 ，构建靶点-通路网络 ，根据 degree 排序 ，发现 KEGG 通路富集前 5 位的依次是肿瘤信号通路（hsa05200，degree=49）、AGE-RAGE 信号通路（hsa04933，degree=27）、TNF 信号通路（hsa04668，degree=22），HIF-1 信号通路 （hsa04066，degree=20） 、铂耐药信号通路（hsa01524，degree=16），提示六味地黄丸越可能通过这些通路发挥作用。

2.6 分子对接

将 PPI 网络中排名前 5 的靶点蛋白分别与槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）、薯蓣皂苷（Diosgenin）和四氢鸭脚木碱（Tetrahydroalstonine）进行分子对接验证，以对接分数来评价核心成分与靶点之间的相互作用，若结合能＜0，表明配体分子均能和受体蛋白自发地结合，结合能＜-5.0 kcal∕mol，表明其结合性好，结合能越小对接越好。然后将 5 个靶点蛋白与其原配体进行对接，得到的对接分数作为参照，用于评价 4 个核心成分与靶点蛋白的对接结果，见表3。从结果可以看到，4 个核心成分与靶点蛋白均能较好的对接，JUN 与山柰酚的结合优于原配体，MAPK1、IL-6、AKT1、MAPK8 与薯蓣皂苷结合优于原配体。

表2 六味地黄丸活性成分预测出的 156 个作用靶点 GO 富集分析

表3 靶点蛋白与六味地黄丸中 4 个核心成分及原配体的对接分数∕（kcal∕mol）

将前五个靶标基因结合最好的化合物进行分子对接展示 ，详见图3。 其中山柰酚（kaempferol）与JUN 结合最好，薯蓣皂苷（diosgenin）与 MAPK1、IL-6、AKT1、MAPK8 结合最优 。 图3A 为 kaempferol 和JUN 之间的结合模式，氨基酸残基 Ser155、Asn156、Lys55 与 kaempferol 配体小分子形成氢键相互作用，氨基酸残基 Val158、Ala113、Met111、Asp112、Ile32、Ala53、Val40、Gly35、Leu168 与 kaempferol 配体小分子形成疏水相互作用 ，图3B 为 diosgenin 和 MAPK1之间的结合模式，氨基酸残基 Thr110、Glu109、

Ile31、Gly32、Val39、Glu33、Gly34、Tyr36、Asp167、Asn154、Leu156、Ser153、Met108、Asp111、Lys114 与diosgenin 配体小分子形成疏水相互作用，图3C 为diosgenin 和 IL-6 之间的结合模式 ，氨基酸残基Asn63、Pro65、Glu93、Tyr97、Thr143、Leu147、Lys150与 diosgenin 配体小分子形成疏水相互作用，图3D 为diosgenin 和 AKT1之间的结合模式 ，氨基酸残基Gly311 与 diosgenin 配体小分子形成氢键相互作用，氨基酸残基 Phe161、Tyr160、Gly162、Gly159、Val164、Asp292、Lys276、Leu295、Thr312 与 diosgenin配体小分子形成疏水相互作用，图3E 为 diosgenin 和MAPK8 之间的结合模式，氨基酸残基 Lys153 与 diosgenin 配体小分子形成氢键相互作用，基酸残基Asp169、Ser155、Asn114、Leu168、Ser34、Ile32、Gly33、Val40、Lys55、Gly35、Gln37、Ala36、Asp151 与diosgenin 配体小分子形成氢键相互作用。

图1 156个六味地黄丸抗胃腺癌的可能作用靶点的蛋白质相互作用网络 图2 六味地黄丸有效成分-抗胃腺癌核心靶点网络 图3 六味地黄丸活性化合物成分和抗胃腺癌活性蛋白质相互作用分析：3A为山柰酚和JUN之间的结合模式；3B为薯蓣皂苷和MAPK1之间的结合模式；3C为薯蓣皂苷和IL-6之间的结合模式；3D为薯蓣皂苷和AKT1之间的结合模式；3E为薯蓣皂苷和MAPK8之间的结合模式

3 讨论

六味地黄丸源于宋代医学家钱乙的《小儿药证直诀》，由熟地黄、丹皮、山药、山茱萸、泽泻、茯苓 6味药组成，是滋补肾阴的名方。近代研究表明，六味地黄丸具有防治胃癌的作用。如石金凤研究发现中、高剂量六味地黄丸联合 5-氟尿嘧啶（5-Fu）可显著抑制胃癌细胞的生长，且可减轻 5-Fu 注射液对胃癌荷瘤鼠的毒副作用。江良县通过临床研究发现，六味地黄丸联合 FOLFOX6 方案可延长晚期胃癌病人的生存期，降低化疗毒副反应，提高化疗疗效。简咏梅等报道六味地黄丸可显著降低胃癌相关炎性因子的表达而降低糖尿病小鼠胃癌的发生风险。但六味地黄丸治疗胃癌的作用机制及有效成分尚不明确。因此，本研究采用网络药理学方法探讨六味地黄丸抗胃腺癌的作用机制，从全方六味中药获得 508 个成分，按 OB≥30%，DL≥0.18 筛选，共获取 69 个有效成分，将有效成分靶点与疾病相关靶点进行比对后，得到 156 个六味地黄丸抗胃腺癌的可能作用靶点。对其进行拓扑分析发现 20 个重要核心靶点 ，依次是 JUN、MAPK1、IL-6、AKT1、MAPK8、VEGFA、MYC、ESR1、EGF、HSP90AA1、RELA、FOS、EGFR、CCND1、AR，MMP9、STAT1、IL1B、PPARG、PTGS2。在药物有效成分-靶点网络中对 20个核心靶点再分析，根据 degree 降序可发现其中槲皮 素（quercetin，MOL000098）与18个核心靶点相关，山柰酚（kaempferol，MOL000422）与 9 个核心靶点相关，薯蓣皂苷（diosgenin，MOL000546）与4个核心靶点有关 ，四氢鸭脚木碱（Tetrahydroalstonine，MOL008457）与 4 个核心靶点有关。推测槲皮素及山柰酚是六味地黄丸抗胃腺癌的主要成分，其次是薯蓣皂苷及四氢鸭脚木碱。

进一步通过 GO 功能富集分析，可以发现六味地黄丸的作用涉及多个生物学过程，并更可能通过细胞毒性、氧化应激、代谢及凋亡功能发挥其抗胃腺癌的作用。通过 KEGG 通路富集分析，我们共发现 36 条相关信号通路，其中 Cancer 信号通路、AGERAGE 信号通路、TNF 信号通路富集较集中，其次是HIF-1信号通路及 Platinum drug resistance 信号通路，推测这些通路可能是六味地黄丸发挥作用的主要信号通路。进一步通过有效成分-靶点-通路富集分析发现，槲皮素、山柰酚、薯蓣皂苷和四氢鸭脚木碱主要通过 AGE-RAGE 信号通路和 TNF 信号通路发挥作用。AGE-RAGE 信号通路在胃癌的发生、发展和转移中发挥着重要作用，研究表明，槲皮素能通过抑制 RAGE 基因的表达，提升细胞凋亡与自噬作用 ，增加肿瘤细胞的死亡率达到抗癌的功效。TNF 信号通路中的多个蛋白在胃癌细胞的增殖、生存等过程中起着重要作用，研究表明槲皮素和山柰酚均可通过调节 TNF 等凋亡基因的表达抑制肿瘤的增殖，薯蓣皂苷可通过上调 TNFR1∕TNF-α 的 mRNA 的表达显著抑制胃癌细胞 HGC-27的增殖。以上的结果表明，熟地、丹皮、山药、山茱萸、茯苓、泽泻可通过多个成分对胃腺癌多个靶点及多条通路作用，不局限于单一成分、单一靶点及单一通路。槲皮素、山柰酚、薯蓣皂苷及四氢鸭脚木碱可能是六味地黄丸的主要有效成分，可通过多个靶点对 Cancer 信号通路 、AGE-RAGE 信号通路、TNF 信号通路发挥作用。六味地黄丸的其他有效成分也参与调控了多个靶点及通路，体现了六味地黄丸多成分、多靶点、多通路协同作用抗胃腺癌的机制。根据以上结果，我们发现在铂耐药通路中同样有多个靶点富集，这与目前临床研究六味地黄丸联合化疗治疗晚期胃癌可抑制肿瘤生长，提高化疗疗效，改善病人生存质量不谋而合，值得今后根据有效成分、作用靶点及信号通路进一步研究。

综上所述。本研究从网络药理学角度对六味地黄丸治疗胃腺癌的有效成分、核心靶点、作用通路进行了分析，并基于分子对接技术模拟其可能分子作用机制，为下一步实验研究六味地黄丸治疗胃腺癌提供了理论依据和线索。当然，由于本研究是基于现有数据库进行的理论推测，其中可能存在假阴性或者假阳性的结论。均有待于进一步的实验验证。