miR-155和miR-200b基因多态性与云南汉族人群宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的相关性*

李娅亨， 杨希， 杨佳， 肖云， 许金美， 张新文， 朱小永， 姚宇峰， 严志凌**

(1.中国医学科学院 & 北京协和医学院 医学生物学研究所， 云南 昆明 650118； 2.昆明医科大学第三附属医院 妇科， 云南 昆明 650118； 3.昆明医科大学第三附属医院 重症医学科， 云南 昆明 650118)

宫颈癌(cervical cancer, CC)在全球女性恶性肿瘤中排名第4，其发病率和死亡率近年来呈现年轻化的趋势[1]。CC的发生和发展主要分为两个阶段：宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和CC[2]。研究发现CC的发生和发展是多种因素长期相互作用导致的结果[3]。持续的高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是CC发生的必要条件之一，但是并非所有感染HPV的患者均发展成CC。此外，宿主的遗传因素在CC的发生和发展中也发挥着重要的作用[4]，近年来，微RNA(miRNA)及其多态性与CC的相关性研究已成为世界范围内的研究热点。miRNA是一类长度约为21～23个核苷酸的非编码单链RNA分子，可以通过碱基互补的方式与靶基因mRNA的3-UTR结合，导致靶基因mRNA的降解或翻译过程的抑制[5]，从而对靶基因的表达进行调控。大量研究表明miR-155和miR-200b在多种人类肿瘤中发挥作用[6-9]，其中包括CC[10-12]。而位于miRNA 基因初级转录本(pri-miRNA)或前体miRNA(pre-miRNA)序列中的变异位点可能会通过影响miRNA的剪切、加工和成熟过程影响成熟 miRNA 的表达，位于miRNA基因成熟序列中的变异可能会影响 miRNA与靶基因的结合，从而影响其对靶基因表达的调控，这可能是miRNA的基因变异在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用的机制之一[5]。研究表明，miR-155和miR-200b基因中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNPs)位点与多种恶性肿瘤密切相关[13-14]。例如，一些研究报道了miR-155基因的SNPs位点rs767649(T>A)与肿瘤的相关性，但不同研究的结论存在分歧[15-17]，该位点与肿瘤发生的相关性尚未明确；而对于miR-200b基因中的SNPs位点rs9660710(C>A)与肿瘤的相关性研究较少[18-19]。因此，本研究选取miR-155基因SNPs位点rs767649(T>A)和miR-200b基因SNP位点rs9660710(C>A)，探究上述SNPs位点在云南汉族人群中CIN患者、CC患者及健康人群中的分布情况，并分析它们与CC发生风险的相关性。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1对象及分组 遵循知情同意原则，随机选取 2016年4月—2018年10月于被诊断为CIN患者258例作为CIN组、被诊断为CC患者438 例作为CC组；选取同期参加体检的HPV 阴性的健康女性511例作为对照组。CC组和CIN组患者符合《临床诊疗指南-妇产科学分册》相关诊断，年龄30～75岁，CC患者的临床分期采用国际妇产科协会(federation international of gynecology and obstetrics，FIGO)的临床分期标准进行分期；排除采样前接受过放化疗等抗肿瘤辅助治疗者，患其他恶性肿瘤者。所有纳入本研究的个体均为云南地区的汉族人群。

1.1.2主要试剂和仪器 QIAamp全血基因组 DNA 提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，QIAGENE公司，德国)，基因分型试剂(TaqMan Genotyping Master Mix，ABI公司，美国)，TaqMan探针分型试剂盒(rs767649探针试剂盒编号为C__212229_10，rs9660710探针试剂盒编号为C__30237426_20，ABI公司，美国)，ND-2000微量紫外可见分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，QuantStudio 6实时荧光定量PCR仪(ABI公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1全血基因组DNA的提取 采用EDTA·K2或肝素抗凝管，采集研究对象的空腹静脉血5 mL，使用QIAamp全血基因组DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA，使用超微量紫外可见分光光度计ND-2000检测基因组DNA的浓度和纯度，存放于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2基因分型 采用TaqMan探针基因分型法对2个SNPs位点rs767649和rs9660710进行基因分型，反应体积为5 μL(384孔板)，PCR反应设阴性对照(以无酶无菌双蒸水代替模板DNA)。反应程序为95 ℃预变性10 min，92 ℃变性15 s、60 ℃退火1 min，40个循环，40 ℃长延伸5 min。基因分型原始数据采用QuantStudioTMReal Time PCR软件进行分析，分型完成后随机选取每个位点不同基因型的样本进行测序验证。

1.3 统计学分析

使用SPSS 19.0软件进行数据的统计分析，采用单因素方差分析比较各组间的年龄差异，采用哈迪-温伯格平衡(hardy-weinbergequilibrium，HWE)检验样品的代表性，采用χ2检验对2个SNPs位点rs767649和rs9660710的等位基因和基因型在3组中的分布频率进行比较。采用遗传模式分析软件SNPStats分析rs767649和rs9660710的基因型与CC的相关性[20]，本研究纳入分析的遗传模式包括共显性遗传模式(codominant)、显性遗传模式(dominant)、隐性遗传模式(recessive)、超显性遗传模式(overdominant)及逻辑累加模式(Log-additive)，并计算赤池信息量准则(akaikeinformationcriterion，AIC) 和贝叶斯信息准则(bayesianinformationcriterions，BIC) 的数值，选取AIC和BIC数值最小的模式为最优遗传模式；统计学分析过程中的多重比较采用Bonferroni校正，当校正后P<0.025(0.05/n,n=2)时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象基本特征

本研究共纳入参加体检的正常健康女性511例，平均年龄(47.07±7.27)岁；CIN组258例，平均年龄(46.08±9.57)岁；CC组438例，平均年龄(46.43±11.58)岁，鳞癌、腺癌及其他类型分别为363、59及16例；各组研究对象年龄比较，差异无统计学意义(F=1.069，P=0.344)。

2.2 样本代表性分析

本研究采用HWE平衡检验样本的群体代表性，结果显示rs767649(T>A)和rs9660710(C>A)的基因型在对照组、CIN 组及CC组中的分布特征均符合HWE平衡(P>0.05)，表明本研究所纳入的样本具有群体代表性。见表1。

表1 各组研究对象rs767649和rs9660710的Hardy-Weinberg检验

2.3 rs767649和rs9660710位点的等位基因和基因型在对照组、CIN组及CC组的分布

结果显示，miR-200b基因SNPs位点rs9660710的等位基因和基因型在CC组和对照组的分布频率比较，差异有统计学意义(P=0.009、0.023)，该位点等位基因A可能是CC发生的风险因素(OR=1.275, 95%CI为1.062～1.530)；miR-155基因SNPs位点rs767649的等位基因和基因型在3组间的分布频率比较，差异无统计学意义(P>0.025)，表明该位点与CC和CIN的发生风险无关。见表2和表3。

表2 rs9660710的等位基因和基因型在3组中的分布

表3 rs767649的等位基因和基因型在3组中的分布

2.4 遗传模式的分析

结果显示，miR-200b基因SNPs位点rs9660710在CC组与对照组的比较中最优的遗传模式为隐性遗传模式(该模式具有最小的AIC和BIC数值)，在该模式下基因型CC-CA相对于基因型AA来说是CC发生的保护性因素(OR=0.65， 95%CI为0.47～0.90，P=0.01)，miR-155基因SNPs位点rs767649位点的基因型在各组研究对象间的分布频率比较，差异无统计学意义(P>0.025)。见表4和表5。

表4 SNPs位点rs767649和rs9660710在CC组和对照组比较中的遗传模式分析

表5 SNPs位点rs767649和rs9660710在CIN组和对照组比较中的遗传模式分析

3 讨论

越来越多的证据表明，除了高危HPV感染外，宿主的遗传因素在CC的发生和发展中发挥着重要的作用[21]。SNPs是人类基因组中广泛存在的遗传标记，位于miRNA基因中的SNPs具有不同的生物学功能，可能会导致miRNA的异常表达，并影响疾病的发生[22]。因此本研究选取2个位于miRNA基因中的SNPs位点(miR-155基因的rs767649和miR-200b基因的rs9660710)，研究其与CIN和CC发生风险的相关性。

人类miR-155是由非转录B细胞整合簇(B cell integration cluster，BIC)基因编码，位于21q21.3号染色体，是一类典型的多功能miRNA，涉及到许多关键的细胞功能，包括免疫应答，DNA损伤应答，炎症以及肿瘤发生等，与多种恶性肿瘤密切相关[23]，在多种癌症中表现为促癌的作用[8-9,24-25]。多项研究表明miR-155的表达在CC组织中明显上调，且与FIGO分期、淋巴结转移、血管浸润及HPV相关，敲低miR-155表达可在体外抑制细胞的增殖、迁移及侵袭[26-27]。近年研究发现miR-155基因SNPs位点与多种人类疾病有相关性[28-30]。其中SNPs位点rs767649(T>A)位于miR-155的启动子区域内，Xie等[15]研究发现在肺癌中该位点T等位基因可能会增加miR-155的转录活性，促进肿瘤的生长和转移，从而促进肺癌的发展风险，降低患者对放化疗的敏感性，导致较差的预后效果。这与Dezfuli等[16]在伊朗人群中发现该位点等位基因A可能是非小细胞肺癌的保护性因素是一致的。同样地，Ji等[17]发现肝细胞癌中miR-155在癌组织和癌旁组织中高表达，该位点的等位基因T与miR-155在肝癌组织和癌旁非肿瘤组织中的高表达有关，且可能与肝细胞癌的患病风险增加和预后不良有关。但是Wang等[13]研究表明，该位点等位基因T可能与miR-155的转录活性降低有关，TT基因型是CC的保护性因素。本研究结果显示rs767649(T>A)与CC的发生风险无相关性(P>0.025)。以上研究表明，miR-155基因中的SNPs位点rs767649在不同肿瘤以及相同肿瘤中的研究结果均存在不一致的情况，这可能是由于不同研究选择的疾病类型不一样，不同类型的肿瘤的发病机制可能不同，因此miR-155发挥的作用也可能不同；也有可能是由于不同研究选择的研究人群不同，不同的研究人群可能具有不同的遗传背景，在不同的遗传背景下该SNPs位点发挥的作用可能会受到影响；同时，不同研究纳入的样本数量不同也会对相关性研究的结果产生影响。Wang等[13]研究与本研究结果不一致的情况表明该位点与中国人群CC发生风险的关系还未明确。因此，未来可考虑开展更大样本量的相关研究，以阐明miR-155基因SNPs位点rs767649与CC发病风险的关系。

人类miR-200家族由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-429及miR-141组成，有研究已表明，miR-200b为上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的有效调节剂，可通过调节E-cadherin和波形蛋白等表达参与多种癌症的转移过程[31]。Zeng等[18]研究表明，miR-200b可以直接靶向FoxG1，从而促进CC的发展；然而Cheng等[19]研究表明，miR-200b可以通过抑制RhoE的表达，抑制CC的EMT过程，从而可能成为CC转移患者的治疗靶标；Xie等[14]研究表明，位于miR-200b、miR-200a及miR-429启动子CpG岛的rs9660710(C> A)在由C转变为A后会导致该CpG位点丢失，这可能会阻止CpG位点的甲基化并增加相关miRNA的表达，从而与非小细胞肺癌发生风险相关。而目前尚未有对于该SNPs位点与CC的相关性研究。本研究结果显示，miR-200b基因SNPs位点rs9660710(C>A)等位基因A可能是云南人群CC发生的风险因素(OR=1.275， 95%CI为1.062～1.530，P=0.009)。该位点CC-CA基因型相对于AA基因型来说是云南人群CC发生的保护性因素(OR=0.65, 95%CI为0.47～0. 90P= 0.01)，该结果与Xie等[14]在肺癌中的研究结果一致。因此，本研究推测rs9660710位点可能是通过影响miR-200b基因启动子区域的甲基化来影响相关基因的转录活性，影响成熟miR-200b的表达，并进一步影响下游的靶基因的表达，促进CC细胞的增殖、迁移及侵袭等，影响细胞的EMT过程，从而与CC的发生风险具有相关性。

综上所述，本研究结果显示位于miR-200b基因SNPs位点rs9660710(C> A)可能与云南地区汉族人群CC发生风险相关，该位点等位基因A可能是CC发生的风险因素。由于该位点位于miR-200家族启动子CpG序列，因此，该位点可能会通过影响启动子区域的甲基化来影响miR-200家族相关miRNA的表达，但该位点与CC发生风险相关的机制仍然需要开展相关的功能研究进行验证。