止血精胶囊的制备工艺及质量标准的建立*

梅瑶， 徐国波， 关焕玉， 廖尚高， 何迅， 席晓岚

(贵州医科大学 药学院， 贵州 贵安新区 550025； 国家苗药工程技术中心 & 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心， 贵州 贵阳 550004)

白芨为兰科植物白芨(Bletillastriata)的干燥块茎，其味苦、甘、涩，性微寒，具有清热利湿、收敛止血、消肿生肌之功效[1-3]，临床上主要用于吐血、止血、外伤出血、疮疡肿毒以及皮肤皲裂等治疗[3-5]。近几年来，针对白芨多糖化学成分、药理学、制剂学等方面进行研究，董永喜等[6]发现白芨多糖(BSP)可通过升高血小板聚集率来调节纤溶系统，发挥止血作用；武桂娟等[7]通过小鼠实验模型，发现BSP止血机制主要是增强血小板第Ⅲ因子活性、缩短凝血酶生成时间，形成人工血栓发挥止血作用。BSP中以白芨胶入药时，可制成散剂、乳膏剂、涂膜剂片剂、膜剂、凝胶剂和口腔黏附片等[8-10]。白芨药材中除了含有多糖组分外，还有较多非多糖物质，如三萜类、联菲类、二氢菲类、联菲醚类、联菲葡萄糖苷类以及菲并吡喃类等[11-13]。本课题在前期研究中，发现白芨非多糖组分也具有较好的止血药效，可显著缩短肝素化的小鼠凝血时间和出血时间，其止血机制与刺激血小板活化、增强血小板聚集、抑制纤维蛋白降解有关[14-17]；同时发现白芨非多糖组分中单体化合物4-hydroxymeth ylphenylβ-D-glucoside、白藜芦苷(blestroside)、裸子苷Ⅰ (gymnoside Ⅰ)、裸子苷Ⅸ(gymnoside Ⅸ)和armatuside能显著促进血小板聚集作用。白芨苷、1-对羟基苄基-4-甲氧基菲-2,7-二醇(1-p-hydroxybenzyl-4-methoxyphenanthrene-2,7-diol)、α-异苹果酸(α-isobutylmalic acid)、裸子苷Ⅰ (gymnoside Ⅰ)、裸子苷Ⅸ(gymnoside Ⅸ)和白藜芦苷(blestroside)可显著缩短肝素化小鼠的CT值[18]。除白芨非多糖组分药理研究之外，其在制剂方面的研究未见报道，且临床上使用的白芨药品多为含白芨的中药复方制剂，缺乏有关白芨止血有效组分(除多糖外)或有效成分的研究，严重制约了白芨产品的深度开发。因此，为了开发白芨相关制剂产品，本课题在前期研究基础上，将白芨非多糖部分与辅料混合制成硬胶囊——止血精胶囊，并对止血精胶囊的质量控制进行研究，为其工艺生产和临床使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1药材与主要试剂 药材白芨(批号20180906，安龙县欣蔓生物科技有限责任公司)由贵州医科大学药学院生药学与药用植物学教研室龙庆德副教授鉴定为兰科植物白芨Bletillastriata(Thunb.) Reichb. F.的干燥块茎，药用淀粉、糊精、微晶纤维素以及甘露醇(贵州欣紫鸿药用辅料有限公司)，3号明胶空心胶囊(浙江省康奥健胶囊有限公司)、D101大孔树脂(青岛海洋化工有限公司)、95%食用酒精(批号180816，东新化工有限公司)、白芨苷对照品(批号DST-190219-100，成都德思特生物技术有限公司)，氯仿、乙酸乙酯为分析纯，甲醇为色谱纯，水为超纯水。

1.1.2主要仪器 XB-HP中药材粉碎机(山东临清宏源制药设备有限公司)、OSB-2100旋转蒸发仪(日本EYELA，东京理化器械株式会社)、Aglient 1260高效液相色谱(HPLC，安捷伦科技有限公司)、AE 2401十万级电子天平(梅特勒，托利多仪器上海有限公司)、KQ-250 DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、SC082768型纯水机(四川沃特水设备有限公司)、DZF-6050型真空干燥箱(上海博讯有限公司医疗设备厂)、升降崩解仪(南京温诺仪器有限公司)、DK-98-11电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)、DZF-6050型真空干燥箱(上海博讯有限公司医疗设备厂)、胶囊板(浙江省康奥健胶囊有限公司)。

1.2 方法

1.2.1止血精胶囊的提取工艺 白芨块茎经粉碎机打成粉末(过4号筛)，称取白芨粉末6.5 kg，用4倍量95 %乙醇回流提取，2 h/次，提取3次；合并3次滤液后浓缩至浸膏，浸膏用水溶解后上大孔树脂D101柱色谱(树脂6 cm,75 cm)，经水洗脱后，用80%乙醇溶液洗脱；收集并合并80%乙醇洗脱液，浓缩至稠膏，55 ℃真空干燥，制得止血精胶囊内容物，提取率为2.6%。

1.2.2止血精胶囊的制备工艺 称取白芨非多糖浸膏粉(过60目筛)与稀释剂微晶纤维素按1 ∶1混匀，加入一定量的75%乙醇作为润湿剂(喷洒加入、少量多次)制软材直至“手握成团、触之即散”；过20目筛挤压制粒，将湿颗粒于60 ℃下干燥，取干燥好的颗粒整粒，过40～80目筛，去除细粉，即得粒度40～80目的胶囊填充物，装入3号空心胶囊，即得止血精胶囊。

1.2.3止血精胶囊的质量标准研究 (1)依照《中国药典》2015 年版四部通则0103 胶囊剂[19]，检查胶囊水分、装量差异和崩解时限;(2)薄层鉴别：称取3批胶囊内容物40 mg研细，加入甲醇10 mL，超声30 min后过滤，获得供试品溶液。取白芨苷对照品适量，加甲醇超声溶解后制成浓度为1 g/L的对照品溶液。以空白辅料的甲醇溶液作为阴性对照溶液，选择氯仿 ∶乙酸乙酯 ∶甲醇 ∶水=4 ∶3 ∶3 ∶0.25为展开剂，显色剂为10%硫酸乙醇溶液；吸取配制好的上述溶液分别点样于同一硅胶板上，放置于层析缸中展开，取出晾干，喷上显色剂后，于电炉上方105 ℃烘烤加热至显色清晰。

1.2.4白芨苷含量的测定 (1)色谱条件 ：Waters Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×150 nm×5 μm)，保护柱为Phenomenex Security Guard C18，柱温40 ℃，流动相为甲醇 ∶水(40 ∶60)，检测波长为223 nm，流速1.0 mL/min，进样体积10 μL；理论塔板数以白芨苷计数应不低于5 000，白芨苷与其它色谱峰分离度>1.5，对照品溶液、供试品溶液与阴性样品溶液色谱图见图1;(2)对照品溶液的制备：称取白芨苷标准品5.09 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解定容后，制成浓度为0.509 g/L的储备溶液，摇匀，4 ℃冰箱保存备用;(3)供试品溶液的制备：称取胶囊内容物0.2 g，置于圆底烧瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流处理2 h，冷却至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤。量取续滤液5 mL转移至25 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，即得;(4)阴性样品溶液的制备：按照止血精胶囊处方比例及制备工艺，制成缺白芨非多糖组分的阴性样品溶液，按“(3)”方法处理，即得。

注：A为白芨苷对照品溶液，B为供试品溶液，C为阴性样品溶液。

2 结果

2.1 性状

胶囊剂每粒间无黏结，外观干净整洁、没有渗漏和囊壳破裂，胶囊内容物均为黄棕色颗粒、没有结块现象，味微苦、无异味。

2.2 薄层鉴别

供试品溶液与对照品溶液在对应位置上均显示相同颜色的斑点，且辅料对其无干扰。见图2。

注：1为对照品溶液，2、3、4为不同批次供试品溶液，5为阴性对照溶液。

2.3 水分、装量差异和崩解时限

3批样品(S1、S2和S3)含水量均<9.0%。装量差异中取3批止血精胶囊各10粒，进行检查，由表1可知，3批胶囊剂装量差异均在±10%内，符合规定。依据《中国药典》2015 年版四部通则0921崩解时限检查法，3批止血精胶囊均在30 min内崩解，符合药典对硬胶囊剂崩解时限的要求。

表1 3批胶囊(每批10粒)装量差异结果

2.4 白芨苷的含量测定

2.4.1线性关系考察 精密量取“1.2.4(2)”项下制备的对照品储备液2.0、1.6、1.0、0.8、0.5和0.25 mL，分别置于25 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，混匀，制得浓度为40.72、32.58、20.36、16.29、10.18和5.09 mg/L的系列对照品溶液。按“1.2.4(1)”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度为横坐标(X)，进行线性回归。白芨苷回归方程：Y=13 933X+24.413(r=0.999 9)，表明白芨苷检测浓度线性范围为5.09～40.72 mg/L，在上述浓度范围内，白芨苷峰面积与对应浓度线性关系良好。

2.4.2精密度试验 取“1.2.4(3)”项下供试品溶液(编号S6)，按照“1.2.4(1)”项色谱条件下连续进样6次，测定白芨苷峰面积，计算得到白芨苷峰面积的RSD为0.23%，表明仪器精密度良好。

2.4.3重复性试验 取样品S6共6份，每份约0.2 g，按“1.2.4(3)”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.4(1)”项色谱条件，于223 nm波长下测定峰面积按照外标法计算样品含量，测定6份样品含量的RSD。计算得到白芨苷的平均含量为26.27 mg/g，RSD为0.33%，表明该方法重复性良好。

2.4.4加样回收率试验 称取已知含量的样品(编号S6)9份(每份约0.1 g)，按样品中白芨苷本底含量加入50%(3份)、100%(3份)、150%(3份)质量的对照品，按照“1.2.4(3)”项下方法制成低、中、高3个质量浓度的加样回收样品溶液，在“1.2.4(1)”项色谱条件下进样测定，计算回收率和RSD。由表2结果计算得出白芨苷的加样回收率平均值为100.48%，RSD为2.52%。

表2 加样回收率试验结果

2.4.5稳定性试验 取供试品溶液S6，分别于室温下放置0、2、4、8、16 h按照“1.2.4(1)”项色谱条件下，于223 nm波长下测定白芨苷峰面积，经计算白芨苷峰面积RSD为0.38%，表明供试品溶液在室温条件下16 h内稳定。

2.4.6样品含量测定 分别取10批止血精胶囊胶囊样品，按“1.2.4(3)”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.4(1)”项下色谱条件下，于223 nm波长下测定白芨苷峰面积，按外标法计算胶囊中白芨苷的含量，每份样品测定3次，取平均值，结果见表3。

表3 白芨苷含量测定结果

3 讨论

白芨具有很重要的临床药用价值，特别是在止血方面，前期已经证明其主要成分非多糖表现出显著优势，故本研究在前期基础上将白芨非多糖部分制备为胶囊剂，结果表明制备工艺稳定、质量可控，也提高了药物稳定性。

通过粉体学研究，发现白芨非多糖浸膏粉极易吸潮，直接罐装会影响其质量，故进行了辅料和润湿剂的考察，而辅料的筛选、用量是实验的关键所在。本实验根据参考文献[20-21]，进行了辅料用量和种类的考察，先后考察了淀粉、糊精、甘露醇和微晶纤维素，浸膏粉与不同辅料混匀后，其吸湿性和流动性均降低。其中，以微晶纤维素为辅料时，休止角为30.28 ℃，小于选用其余3种辅料时的休止角；且在湿度环境为75 %下，12 h后，仍呈粉末状(吸湿率为11.13 %，均小于其余3种辅料)，故选择微晶纤维素作为辅料制备胶囊剂。考察了不同比例的药粉与微晶纤维素混合(10 ∶1、5 ∶1和1 ∶1)，发现药粉与微晶纤维素为1 ∶1混合时，休止角最小，浸膏粉的流动性得到了改善，吸湿性最低。

有研究表明，乙醇的浓度与用量对颗粒剂的成型具有直接的影响[22]，故进行了乙醇浓度的考察，发现乙醇浓度为75%时，黏性适中、不起团、易过筛，制成的颗粒收率达到了80 %，且流动性和吸湿性均符合胶囊剂的要求。

结合白芨非多糖提取率及白芨临床用量，表明止血精多糖胶囊每天的服用剂量为0.78 g，若每天服用3次，每次2粒，则每粒胶囊质量为0.13 g(含生药量2.5 g),则所需胶囊体积为0.28 mL,而3号胶囊体积为0.3 mL,故用3号胶囊灌装。

本实验在对TLC条件进行筛选时，考察了氯仿:乙酸乙酯 ∶甲醇 ∶水、氯仿 ∶甲酸 ∶甲醇以及正丁醇 ∶乙酸乙酯 ∶水体系，发现后两者萃取得到的色谱图均出现拖尾现象，且分离时间长。而前者分离度良好，得到的色谱图斑点清晰分明，且重现性好。故最终确定展开剂为氯仿 ∶乙酸乙酯 ∶甲醇 ∶水(4 ∶3 ∶3 ∶0.25)。

研究表明，白芨非多糖中的主要成分为白芨苷[18,23]。因此采用HPLC控制白芨苷的含有量，在进行检测波长的确定时，通过采用二极管阵列检测器，对白芨苷在200～400 nm处进行紫外吸收全波长扫描，发现白芨苷在223 nm检测波长条件下基线平稳，色谱丰度较好；在进行柱温考察时，通过考察色谱柱温在25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃时的分离效果，发现当柱温为30 ℃时，白芨苷以及各样品溶液分离效果最佳。HPLC法简便、准确，重复性良好，可用于白芨非多糖止血精胶囊的质量控制。