亚铁螯合酶对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的影响及作用机制研究

孙维栋 余醒醒 安依涵 王鑫 王莹 童向民

活性氧（reactive oxygen species,ROS）是一类由氧形成，并在分子组成上含有氧，化学性质比氧自身活泼的氧原子或原子团[1]，在机体内不断产生及清除的过程中依然保持氧化-还原系统的稳定，并在人体整个生理过程中发挥重要作用。当机体处于疾病状态或受到外源性物质刺激后，这种动态平衡可能被打破，如ROS的产生增多或抗氧化酶的减少（即ROS过剩），触发细胞多个促凋亡通路[2]，对细胞造成伤害，严重时导致细胞凋亡。癌细胞因为相对正常细胞存在致癌刺激、代谢功能增加和线粒体功能障碍[3]，能产生较高水平的ROS。但在持续的氧化应激下，癌细胞通过一系列机制能很好地适应这种压力，不仅可以激活ROS清除系统，还可以抑制细胞凋亡[4]。研究发现，细胞内过多的铁可诱导产生大量的ROS，给细胞带来致命性损伤[5]。铁进入细胞后，被转运入线粒体，或储存在铁蛋白中[6]。铁在线粒体中被用于合成铁硫簇和血红素。而合成血红素的最后一步是二价铁离子嵌入原卟啉Ⅸ，需要亚铁螯合酶（ferrochelatase,FECH）催化。FECH能够与ATP结合盒膜转运蛋白 10（ATP-binding-cassette B 10,ABCB10）以及线粒体转铁蛋白-1（mitoferrin-1,MFRN1）构成一个位于线粒体内膜的铁转运复合体，参与把铁从细胞质转入线粒体的过程[7]。基于此，本研究运用短发夹（shRNA）在体外敲减人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞中FECH的mRNA表达，阻断原卟啉Ⅸ转化为血红素，改变细胞内铁的水平，探讨FECH对RPMI8226细胞ROS产生及对细胞增殖能力的影响和作用机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 RPMI l640培养基、FBS购自美国Gibco公司，L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素购自上海远慕生物科技有限公司，嘌呤霉素购自北京凯瑞基生物科技有限公司。CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物科技研究所，二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）购自天津滨韵科技公司，无RIPA裂解液购自上海碧云天生物科技研究所，SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购自美国 Millipore公司，一抗 FECH（1∶1 000）、铁调节蛋白 2（iron regulatory protein2,IRP2）（1∶1 000）、转铁蛋白受体 1（transferrin receptor1,TfR1）（1∶1 000）、过氧化氢酶（Catalases）（1∶2 000）、β-Actin（1∶6 000）均购自美国赛信通公司，兔抗鼠二抗（1∶5 000）购自上海碧云天生物科技研究所，显影剂购自七海生物科技公司，血清RPMI-1640培养液购自美国Hyclone公司，酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司，流式细胞仪购自美国艾森生物有限公司，双色红外激光扫描成像系统购自美国LI-COR公司，Gel-Pro-Analyzer软件为美国贝塞斯达软件公司产品。

1.2 细胞培养 RPMI8226细胞购自美国模式培养物集存库，293T细胞株购自中国科学院细胞库，常规培养于含 10% FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素/链霉素的RPMI 1640培养液中，置于37℃、含5% CO2和95%空气的潮湿培养箱中培养。

1.3 FECH shRNA的设计、合成和转染 根据FECH基因序列设计靶向FECH序列的FECH shRNA 5'-CCCAAGGGTAATAAACGTGTA-3'，将 FECH shRNA 和空载对照ctrl shRNA质粒转染至293T细胞，转染48h后慢病毒液用0.22μm过滤器过滤并用于转染。RPMI8226细胞在24孔板转染后在37℃温育24 h后用嘌呤霉素（10 mg/ml）逐步筛选，后采用Western blot验证。

1.4 细胞增殖试验 采用CCK-8法。分别将FECH shRNA和空载对照ctrl shRNA转染后的RPMI8226细胞接种在96孔板中（4×103细胞/孔），用含有10% FBS的RPMI 1640培养养液在37℃、5% CO2的培养箱培育，分别在 24、36、48、60、72、84、96 h 后加 CCK-8 10 μl，2 h后在酶标仪450 nm处测定吸光度，测定结果用生长曲线描述细胞增殖情况。

1.5 细胞ROS测定 分别将FECH shRNA和空载对照ctrl shRN转染后的RPMI8226细胞以每孔200×104细胞接种到6孔板，培育8 h后，收细胞PBS洗涤后在1.5 ml EP管内加入无血清RPMI 1640培养液500μl，再加入2μmol/L二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA），在37℃黑暗环境中温育20 min，吹打混匀后在流式细胞仪中测定ROS（激发波长485 nm，发射波长530 nm）。

1.6 细胞铁代谢和抗氧化蛋白表达检测 采用Western blot法。分别将FECH shRNA和空载对照ctrl shRNA转染后的RPMI8226细胞经PBS洗涤后，提取细胞至1.5 ml EP管，加入加酶抑制剂的RIPA裂解液冰上静置 10 min使细胞充分裂解，12 000 r/min离心10 min，取上清液提取总蛋白，并将浓度调至同一浓度。配SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）上样10 ul电泳，然后转膜到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后，孵育一抗 FECH（1∶1 000）、IRP2（1∶1 000）、TfR1（1∶1 000）、Catalases（1∶2 000）、β-Actin（1∶6 000），在 4 ℃过夜，随后与其相应的二抗（1∶5 000）孵育 1 h，用显影剂和Gel-Pro-Analyzer软件来显影和测量相对强度。以β-Actin作为内参。

1.7 统计学处理 采用SPSS21.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FECH敲减RPMI8226细胞的构建验证 分别将FECH shRNA和空载对照ctrl shRNA转染RPMI8226细胞，Western blot验证显示FECH敲减RPMI8226细胞构建成功，见图1。

图1 亚铁螯合酶（FECH）shRNA和空载对照ctrl shRNA转染RPMI8226细胞后FECH表达电泳图

2.2 FECH shRNA RPMI8226细胞和ctrl shRNA RPMI8226 细胞增殖能力比较 培育 24、36、48、60、72、84、96 h时，FECH shRNA RPMI8226细胞吸光度均低于ctrl shRNA RPMI8226细胞（均 P＜0.05），即增殖能力较ctrl shRNA RPMI8226细胞减弱，生长曲线见图2。

图2 亚铁螯合酶（FECH）shRNA RPMI8226细胞和ctrl shRNA RPMI8226细胞生长曲线比较

2.3 FECH shRNA RPMI8226细胞和ctrl shRNA RPMI8226细胞ROS产生情况比较 流式细胞术检测显示，相对ctrl shRNA RPMI8226细胞，FECH shRNA RPMI8226细胞 ROS产生增加（1.52±0.8）倍。

2.4 FECH shRNA RPMI8226细胞和 ctrl shRNA RPMI8226细胞 IRP2、TfR1、Catalases表达情况比较 与ctrl shRNA RPMI8226 细胞相比，FECH shRNA RPMI8226细胞IRP2、TfR1表达上调，Catalases表达下调，见图3。

图3 亚铁螯合酶（FECH）shRNA RPMI8226细胞和ctrl shRNA RPMI8226 细胞铁调节蛋白 2（IRP2）、转铁蛋白受体 1（TfR1）、过氧化氢酶（Catalases）表达情况比较（a为蛋白表达电泳图；b、c、d分别为IRP2、TfR1、Catalase相对表达水平比较）

3 讨论

多发性骨髓瘤是发生于B细胞终末分化阶段的恶性疾病，是恶性浆细胞在骨髓内异常增生，伴有单克隆免疫球蛋白或轻链（M蛋白）过度生成，常合并多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害，引起骨折、骨髓功能衰竭及肾脏疾病，产生一系列临床症状[8]。不进行治疗的进展期多发性骨髓瘤患者中位生存期仅有6个月，而接受传统化疗的中位生存期也不超过3年，仅有25%患者的生存期在5年以上[9]。近几年来，新的治疗药物，如来那度胺和硼替佐米已用于多发性骨髓瘤的治疗，尽管目前治疗有了更好的临床效果，但还有不少患者最终死于复发和难治性疾病，因此需要新的治疗靶点和药物来延长复发时间或更有效地达到治疗目标。ROS在机体的免疫过程和细胞信号转导中起重要作用，当细胞内活性氧过多积聚，超过抗氧化酶系统的清除能力，就会产生氧化应激，引发脂质过氧化反应损伤细胞膜、引起蛋白质变性、酶活性丧失等损害作用[10]。

本研究运用shRNA技术抑制RPMI8226细胞的FECH表达。通过敲减RPMI8226细胞的FECH，研究其引起细胞内ROS水平变化的机制及其对癌细胞增殖的影响，从而为多发性骨髓瘤临床治疗提供新的突破口和治疗靶点。细胞质中铁调节蛋白（iron regulatory proteins,IRPs）监测细胞内铁水平，调节细胞内铁摄取、转运和储存蛋白的合成和表达[11]。RPMI8226细胞的FECH敲减后，线粒体内血红素合成障碍，线粒体向细胞质传递了持续输入铁的信号以恢复血红素的正常合成，引起IRP2表达上调。IRP2表达上调后，IRP2与调节铁反应元件（iron responsive elements,IREs）结合，在转录或转录后水平上促进了TfR1的表达与合成[12]。细胞内TfR1的表达上调，与血液中的转运亚铁离子的转铁蛋白（transferrin,Tf）结合，促进了亚铁离子转入细胞内[13]。而细胞内亚铁离子累积，通过Fenton和Haber-Weiss-like反应产生ROS[14]。细胞内ROS产生增多，造成细胞毒性[11]。同时细细胞内Catalases蛋白水平下降，清除H2O2能力下降[15]，使ROS降解减少，细胞内ROS过剩，细胞抗氧化能力下降，增加了细胞内的氧化应激，造成细胞功能损伤。因此，FECH敲减后的RPMI8226细胞因铁积累后ROS产生增多，同时抗氧化酶减少降低了ROS的降解，打破了细胞内氧化-还原系统的平衡，使细胞内ROS明显增多，产生氧化应激，增加了对细胞的毒性[16]，最终导致细胞增殖能力下降。

综上所述，FECH对维持RPMI8226细胞氧化还原的动态平衡起重要作用。FECH表达受抑制后，RPMI8226细胞IRP2、TfR1表达上调，细胞内铁过载，ROS产生增多，同时抗氧化蛋白Catalases表达下调，细胞抗氧化能力下降，引发细胞氧化应激，抑制细胞增殖。