青藤碱对Heymann肾炎大鼠足细胞损伤的干预作用及机制研究

林宜 孙玥 谭建平 朱斌 高源成 殷佳珍 王文荣 陈洪宇

膜性肾病是机体产生针对肾小球足细胞的自身抗体，并在局部形成免疫复合物损伤足细胞而导致的慢性肾小球疾病，以肾小球基底膜上皮细胞下免疫复合物沉积伴基底膜弥漫性增厚为病理特征[1]。青藤碱为中药青风藤的主要单体生物碱，具有明显抗炎、免疫抑制等药理作用[2-7]。临床研究证实青藤碱治疗慢性肾小球肾炎及IgA肾病患者有效，且不良反应少[8-9]，但其对治疗慢性肾小球疾病的作用机制尚未完全明确。本研究旨在观察青藤碱对Heymann肾炎大鼠足细胞损伤的干预作用，探讨其可能的作用机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验大鼠 体重120～140 g健康雄性SD大鼠100只，由浙江省中医研究院提供[动物许可证号：SYXK（浙）2014-0003]。

1.1.2 主要药物、试剂和仪器 雷米普利片（昆山龙灯瑞迪制药有限公司，5 mg/片）。青藤碱注射液（湖南正清制药集团股份有限公司，每支50 mg/2 ml）。羊抗大鼠Fx1A血清（美国Probetex有限公司，批号：PTX-002S）。GTVision Ⅲ抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒[基因科技（上海）有限公司，批号：GK500705]。抗nephrin抗体-C-terminal[艾博抗（中国香港）贸易有限公司]。抗podocin抗体[艾博抗（上海）贸易有限公司，批号：ab50339]。异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗大鼠IgG[密理博（上海）贸易有限公司，批号：AP189F]。10%中性福尔马林（北京益利精细化学品有限公司）。纯度＞99%戊巴比妥钠（杭州达成生物有限公司）。PBS磷酸盐缓冲液（福州迈新生物技术开发有限公司）。加强型DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。100×柠檬酸组织抗原修复液（福州迈新生物技术开发有限公司）。羊动物非免疫血清（福州迈新生物技术开发有限公司，批号：SPKIT-B2）。病理组织漂烘仪（常州中威电子仪器有限公司）。BMJ-Ⅲ型包埋机（常州中威电子仪器有限公司）。BMJ-Ⅲ型病理组织包埋冷冻台（常州中威电子仪器有限公司）。DNP-9082型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）。电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。STIATOS台式低温高速冷冻离心机（德国贺利氏控股公司）。日立7180全自动生化分析仪（株式会社日立制作所）。RM2235轮转切片机[徕卡显微系统（上海）贸易有限公司]。CM1950冷冻切片机[徕卡显微系统（上海）贸易有限公司]。BX51生物显微镜[奥林巴斯（中国）有限公司]。-20℃普通低温冰箱（青岛海尔特种电器有限公司）。微波炉（格兰仕集团）。代谢笼（浙江省中医研究院自制）。

1.2 方法

1.2.1 被动型Heymann肾炎（passive Heymann nephritis,PHN）大鼠模型制备 大鼠适应性喂养1周，选取24 h尿蛋白定量＜10 mg的健康大鼠为实验对象。禁食给水12 h，按随机数字表法随机分为对照组15只，PHN大鼠模型制作组85只。制作PHN大鼠模型：大鼠尾静脉注射0.4 ml/100 g体重羊抗大鼠Fx1A血清（临用前室温融化，4℃ 3 000 r/min离心5 min，弃沉淀），30 s内缓慢注入。对照组仅尾静脉注射0.4 ml/100 g体重0.9%氯化钠注射液。大鼠造模1周后留取24 h尿液，检测24 h蛋白定量＞10 mg视为造模成功。

1.2.2 实验分组和给药方法 对造模成功的PHN大鼠，按不同给药方案分为5组：青藤碱低、中、高剂量组（青藤碱干预组），雷米普利组，模型组，每组17只。造模后第9天开始，对青藤碱低、中、高剂量组分别按20、40、60 mg/（kg·d）体重腹腔注射青藤碱注射液1次。雷米普利组按5 mg/（kg·d）体重给予雷米普利混悬液（现用现配，研钵充分研磨，再加入0.9%氯化钠注射液配置成0.5 mg/ml的混悬液）灌胃1次。模型组和对照组按雷米普利组等体积0.9%氯化钠溶液灌胃1次。定期称重，根据体重调整给药量。给药第10、20天，每组分别处死5只大鼠，给药第30天处死剩余大鼠。

1.2.3 标本采集 应用代谢笼，留取造模后第7天，给药后第10、20、30天大鼠的24 h尿液以测定尿蛋白浓度。测给药后第10、20、30天大鼠体重，腹腔注射0.45%戊巴比妥钠溶液1 ml/100 g体重进行麻醉。血液标本采集：剖腹暴露腹主动脉，腹主动脉采血1 ml至含EDTA真空采血管，轻轻摇匀，采2 ml血液至普通真空采血管。肾组织标本采集：切取双肾，剥离包膜，迅速切取长3 mm、宽3 mm、厚1.5 mm肾脏皮质组织2块，浸泡于含0.9%氯化钠溶液的离心管中，置于冷藏箱，以备免疫荧光检查；切取长3 mm、宽2 mm、厚1.5 mm肾脏皮质组织2块，浸泡于含3.75%戊二醛的离心管中，置于冷藏箱，以备电镜检查；余组织浸泡于10%甲醛溶液中，以备光镜及免疫组织化学检查。

1.2.4 生化指标测定 （1）24 h尿蛋白检测采用全自动生化分析仪；（2）血清ALT、AST、血肌酐、白蛋白测定采用全自动生化分析仪；（3）血白细胞测定采用全自动血细胞分析仪。

1.2.5 肾脏病理指标检测 取经10%中性甲醛溶液固定后的肾脏皮质组织，常规脱水，石蜡包埋，制成2.5μm切片，行HE、过碘雪夫酸（PAS）、过碘酸六胺银（PASM）染色，光镜下观察并摄片。取经3.75%戊二醛及2%鋨酸双固定后的肾脏皮质组织，丙酮梯度脱水，包埋后切片，醋酸铀和柠檬酸铅双染，水洗后电镜下观察。处死大鼠当天，将浸泡于0.9%氯化钠溶液中的2块肾脏皮质组织进行冷冻切片。切片后水洗，在组织上滴加FITC标记的羊抗大鼠 IgG 50 μl/片（1∶100稀释），将切片置于湿盒中，放于37℃恒温培养箱45 min。取出片子，水洗后荧光显微镜下摄片进行肾脏组织免疫荧光IgG的检测；取各组经10%中性甲醛溶液固定后的肾脏皮质组织，常规脱水，石蜡包埋，制成 2μm切片，67℃恒温烤箱固定24 h，防止脱片，而后进行免疫组化步骤，脱蜡至水，柠檬酸组织抗原修复液高火3 min，再将组织片快速放入，解冻15 min，自然冷却。3%双氧水，灭活内源性过氧化物酶，常温10 min。滴加山羊血清、滴加一抗、二抗，DAB显色，苏木素复染10 min，水洗，乙醇脱水、干片、封片，行podocin、nephrin免疫组化检测。用莱卡病理图像采集系统采集图像。免疫组化、免疫荧光检查每个标本选取5个视野，采用image pro plus6.0软件进行分析，得到PHN大鼠肾小球内IgG、podocin和nephrin的阳性区平均积分光密度。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析；两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠24 h尿蛋白水平比较 给药第10、20、30天，青藤碱低、中、高剂量组和雷米普利组大鼠24 h尿蛋白水平均高于对照组（均P＜0.05）；给药第10天，青藤碱高剂量组低于模型组（P＜0.05）；给药第20天，青藤碱中、高剂量组均低于模型组（均P＜0.05）；给药第30天，青藤碱低、中、高剂量组和雷米普利组间比较均无统计学差异（均P＞0.05）。大鼠24 h尿蛋白水平整体呈青藤碱干预组＜雷米普利组＜模型组的趋势，青藤碱高剂量组＜青藤碱中剂量组＜青藤碱低剂量组的趋势。见表1。

表1 各组大鼠24 h尿蛋白水平比较（mg/24 h）

2.2 各组大鼠血清白蛋白水平比较 给药第10天，青藤碱低、中、高剂量组和雷米普利组大鼠血清白蛋白水平均低于对照组（均P＜0.05），而与模型组比较无统计学差异（均P＞0.05）；青藤碱低、中、高剂量组和雷米普利组各组间比较均无统计学差异（均P＞0.05）。给药第20天，模型组、青藤碱中剂量组均低于对照组（均P＜0.05）；青藤碱低、中、高剂量组和雷米普利组与模型组比较均无统计学差异（均P＞0.05），且青藤碱低、中、高剂量组和雷米普利组各组间比较均无统计学差异（均P＞0.05）。给药第30天，模型组低于对照组（P＜0.05）；青藤碱低、中、高剂量组和雷米普利组与对照组、模型组比较均无统计学差异（均P＞0.05），青藤碱低、中、高剂量组和雷米普利组各组间比较亦无统计学差异（均P＞0.05）。血浆白蛋白水平整体呈对照组＞青藤碱干预组＞雷米普利组＞模型组的趋势。见表2。

表2 各组大鼠血清白蛋白水平比较（g/L）

2.3 各组大鼠血清肌酐、血WBC、血清ALT、血清AST水平比较 给药第10、20、30天，各组大鼠血清肌酐、血WBC、血清ALT、血清AST水平比较均无统计学差异（均 P＞0.05），见表 3～6。

表3 各组大鼠血清肌酐水平比较（μmol/L）

表4 各组大鼠血WBC水平比较（×109/L）

表5 各组大鼠血清ALT水平比较（U/L）

表6 各组大鼠血清AST水平比较（U/L）

2.4 模型组与对照组大鼠肾脏组织病理学变化比较 对照组大鼠肾脏组织病理切片光镜下未见明显异常。模型组大鼠肾脏组织病理切片光镜下见肾小球结构清晰，毛细血管襻开放较好，系膜细胞及系膜基质未见明显增生，可见肾小球基底膜增厚伴钉突形成，基底膜空泡变性。见图1-3（插页）。模型组大鼠肾脏组织行电镜下观察见造模第30天后，大鼠肾脏组织可见较多散在的大小不等的电子致密物在肾小球基底膜内、上皮细胞下沉积，基底膜不均匀增厚，钉突形成，足细胞足突广泛融合。见图4。

图1 模型组与对照组大鼠肾脏组织HE染色病理学变化（a为正常组；b为造模第20天后模型组；c为造模第30天后模型组；d为造模第40天后模型组；×400）

图2 模型组与对照组大鼠肾脏组织过碘雪夫酸（PAS）染色病理学变化（a为正常组；b为造模第20天后模型组；c为造模第30天后模型组；d为造模第40天后模型组；×400）

图3 模型组与对照组大鼠肾脏组织过碘酸六胺银（PASM）染色病理学变化（a为正常组；b为造模第20天后模型组；c为造模第30天后模型组；d为造模第40天后模型组；×400）

图4 模型组大鼠造模第30天后肾脏组织电镜下病理学变化所见（×5 000）

2.5 各组大鼠肾脏组织IgG沉积情况比较 对照组大鼠肾脏组织免疫荧光检查示无IgG沉积。青藤碱低、中、高剂量组和雷米普利组、模型组大鼠肾脏免疫荧光检查均可见IgG沿肾小球毛细血管襻呈弥漫、颗粒状沉积，且给药第10、20、30天，青藤碱低、中、高剂量组和雷米普利组、模型组大鼠肾脏组织免疫荧光IgG阳性区平均积分光密度比较无统计学差异（P＞0.05）。见表7。

表7 各组大鼠肾脏免疫荧光IgG阳性区平均积分光密度比较

2.6 各组大鼠肾脏组织podocin蛋白表达情况比较 各组大鼠肾脏组织免疫组化检查均可见podocin蛋白沿肾小球毛细血管襻表达。给药第10、20、30天，青藤碱低、中、高剂量组和雷米普利组、模型组大鼠肾脏组织免疫组化podocin阳性区平均积分光密度均低于对照组（均P＜0.05），而青藤碱低、中、高剂量组和雷米普利组各组间比较无统计学差异（均P＞0.05）；给药第20天，青藤碱高剂量组高于模型组（P＜0.05）。podocin阳性区平均积分光密度整体呈对照组＞青藤碱治疗组＞雷米普利组＞模型组的趋势。见表8。

表8 各组大鼠肾脏组织蛋白podocin免疫组化阳性区平均积分光密度

2.7 各组大鼠肾脏组织nephrin蛋白表达情况比较 各组肾脏免疫组化检查均可见nephrin沿肾小球毛细血管襻表达。免疫组化nephrin阳性区平均积分光密度的统计分析：给药第10天，模型组、青藤碱低剂量组、青藤碱中剂量组低于对照组（P＜0.05）；各治疗组与模型组之间无统计学差异（P＞0.05）；各青藤碱治疗组之间亦无统计学意义（P＞0.05）。给药第20天，模型组、青藤碱低剂量组低于对照组（P＜0.05），青藤碱高剂量组高于模型组（P＜0.05），各青藤碱治疗组之间亦无统计学意义（P＞0.05）。给药第30天，各组之间均无统计学差异（P＞0.05）。各组nephrin阳性区平均积分光密度整体呈对照组＞青藤碱干预组＞雷米普利组＞模型组的趋势。见表9。

表9 各组大鼠肾脏组织蛋白nephrin免疫组化阳性区平均积分光密度比较

3 讨论

中老年膜性肾病使用常规西药糖皮质激素及细胞毒药物等治疗不良反应较为常见，而中医药治疗膜性肾病有较好效果。中药青风藤自古用于风湿病的治疗，具有抗炎、免疫抑制作用[2，10]。青藤碱为青风藤的主要单体生物碱，研究发现其具有抗炎及免疫抑制作用[11-18]，具有肾脏保护作用[19-29]。

本研究通过尾静脉注射羊抗大鼠Fx1A血清，成功建立PHN模型。结果表明，青藤碱低、中、高剂量组和雷米普利组、模型组大鼠24 h尿蛋白水平均高于对照组；给药第10天，青藤碱高剂量组24 h尿蛋白水平低于模型组；给药第20天，青藤碱中、高剂量组24 h尿蛋白水平均低于模型组。24 h尿蛋白水平整体呈青藤碱干预组＜雷米普利组＜模型组的趋势，青藤碱高剂量组＜青藤碱中剂量组＜青藤碱低剂量组的趋势。与之相应，随着24 h尿蛋白水平下降，血浆白蛋白水平上升，可见青藤碱可减少Heymann大鼠尿蛋白排泄。

膜性肾病的尿蛋白主要与自身足细胞抗原介导的足细胞损伤有关，免疫病理学检查显示上皮下免疫复合物沉积。本研究观察肾脏组织IgG沉积，青藤碱低、中、高剂量组和雷米普利组与模型组之间，青藤碱低、中、高剂量组和雷米普利组之间肾脏组织IgG沉积情况无统计学差异，由此可见，青藤碱并未减少局部免疫复合物沉积。既往研究表明青藤碱可上调阿霉素诱导的大鼠肾脏足细胞nephrin和podocin表达[30]。由此，笔者推测青藤碱也可能通过干预Heymann大鼠足细胞蛋白分子的表达起到保护作用。免疫组化检测podocin表达，显示青藤碱低、中、高剂量组和雷米普利组大鼠肾脏组织podocin阳性区平均积分光密度显著低于对照组；给药第20天，青藤碱高剂量组高于模型组。各组podocin阳性区平均积分光密度整体呈对照组＞青藤碱干预组＞雷米普利组＞模型组的趋势。nephrin的表达结果表明，给药第10天，模型组、青藤碱低剂量组、青藤碱中剂量组显著低于对照组；给药第20天，模型组、青藤碱低剂量组显著低于对照组，青藤碱高剂量组显著高于模型组，各组nephrin阳性区平均积分光密度整体呈对照组＞青藤碱干预组＞雷米普利组＞模型组的趋势。由于足细胞中podocin、nephrin分子是组成足细胞足突裂孔隔膜的缝隙蛋白，是构成肾小球滤过屏障重要组成部分，这些裂孔膜蛋白的缺失或者突变会导致尿蛋白。由此可见，青藤碱可能通过上调PHN大鼠肾脏组织podocin、nephrin的表达，修复足细胞损伤，减少尿蛋白排泄。

此外，本研究中所用青藤碱剂量在治疗PHN大鼠过程中无明显肝肾功能、骨髓的影响。在观察青藤碱疗效的同时，对其神经系统改变进行观察。青藤碱治疗组大鼠腹腔注射后较其他组大鼠表现出短暂性行动迟缓，推测与青藤碱的镇静作用有关，未见抽搐等神经系统不良反应；可见本研究中腹腔注射青藤碱剂量对PHN大鼠无神经系统损伤。

综上所述，本研究结果显示青藤碱可通过上调PHN大鼠肾脏组织podocin、nephrin的表达，修复足细胞损伤以减少PHN大鼠尿蛋白排泄，且其干预作用具有剂量依赖效应，即剂量越大，干预尿蛋白的效果越明显，且本研究中并未见到明显的不良反应。