SLPI在卵巢癌发生、发展中的作用和机制研究

潘淑芬 严育宏 吴洁丽

在全球范围内，卵巢癌是女性最常见癌症之一，为女性癌症死亡的第八位原因，5年生存率低于45%；虽然大多数高收入国家的年龄标准率很稳定或在下降，但许多中低收入国家的年龄标准率都在上升[1-2]。探讨影响卵巢癌发生、发展的机制对于卵巢癌的诊治有重要意义。分泌性白细胞蛋白酶抑制因子（secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI）是一种黏膜上皮细胞分泌的非糖基化单链多肽蛋白，在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达[3]。研究表明，SLPI的表达水平与肿瘤迁移、侵袭能力呈正相关，且SLPI高表达会促进肿瘤细胞增殖，抑制其凋亡[4]。Zuo等[5]发现SLPI在卵巢癌中表达上调，提示SLPI可能与卵巢癌发生、发展有关。基于此，本研究通过构建不同SLPI表达水平的卵巢癌细胞株，探讨SLPI对卵巢癌细胞增殖、凋亡及侵袭、迁移能力的影响，以期为卵巢癌基因靶向治疗药物的研发提供理论依据，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 Nude雌性裸鼠（体重22～25 g，6～7周龄）购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证：北京 SYXK（京）2017-0033。清洁级环境分笼饲养，饲养条件：12 h光照黑暗交替、温度（25±1）℃、相对湿度（60±5）%，自由饮水、进食，1周后开展实验。人正常卵巢上皮细胞株IOSE80购自钰博生物有限公司。卵巢癌细胞系SKOV-3、OVCAR-3、TOV-21G、A2780、OV-1063及人肾上皮细胞系293T购于中国科学院上海细胞库；OptiMEM（批号：31985062，100 ml）购自美国Thermo Fisher公司；FBS（批号：35-081-CV，500 ml）、DMEM 培养基（批号：10-013-CV，500 ml）购自美国 Corning公司；CCK-8试剂盒（批号：C0037，100T）、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（批号：C1062M，50T）购自上海碧云天生物技术有限公司；Transwell小室（批号：3422）、基质胶（批号：356234，5 ml）购自美国Corning 公司；一抗：兔抗 SLPI（批号：89199S，100 μl）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）（批号：13110T，20 μl）、半胱天冬酶 3（Cleaved Caspase-3）（批号：9664T，20 μl）、半胱天冬酶 9（Cleaved Caspase-9）（批号：20750S，100 μl）购自美国 CST 公司；兔抗细胞周期蛋白1（Cyclin D1）（批号：SAB5700635-100UL）、BCL2相关X 蛋白（BCL2 Associated X Protein,BAX）（批号：SAB5700002-100UL）、B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL2）（批号：SAB5700577-100UL）购自美国Sigma公司；兔抗 Actin（批号：ARE6011，100μl）购自杭州华安生物技术有限公司；兔抗基质金属蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2,MMP-2）（批号 10373-2-AP，50 μl）、MMP-9（批号：10375-2-AP，50 μl）、锌指蛋白（Snail 1）（批号：13099-1-AP，50 μl）、锌指转录因子（Slug）（批号：12129-1-AP，50 μl）购自武汉三鹰生物技术有限公司。Lipofectamine 3000（批号：L3000001，0.1 ml）购自美国Invitrogen公司。Trizol（批号：CW0580，100 ml）、超纯 RNA 提取试剂盒（批号：CW0581，50 次）及 UltraSYBR Mixture（Low ROX）（批号：CW2601S，1 ml）购自北京康为世纪生物科技有限公司，PrimeScript RT Master Mix反转录试剂盒（批号：RR036A，200次）购自日本Takara公司。相关仪器：ViiA 7实时荧光定量PCR仪（美国Thermo Fisher公司），化学发光荧光影像分析仪（LAS-4000，日本Fujifilm公司），倒置荧光显微镜（Ti-S，日本尼康公司）等。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 IOSE80、SKOV-3、OVCAR-3、TOV-21G、A2780、OV-1063及293T细胞均培养在含10% FBS、1%青-链霉素双抗的DMEM培养基中，并置于5% CO2、37℃饱和湿度的恒温箱中培养。细胞贴壁生长，待生长汇合度达90%以上时使用胰蛋白酶消化，按照1∶3的比例进行传代，取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.2 卵巢癌细胞SLPI mRNA表达检测 采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）。Trizol法提取卵巢癌 SKOV-3、OVCAR-3、TOV-21G、A2780、OV-1063细胞和人源的正常卵巢上皮IOSE80细胞中mRNA，逆转成cDNA后利用qRT-PCR法检测SLPI mRNA表达，以GAPDH为内参。SLPI上游引物：5'-GAGATGTTGTCCTGACACTTGTG-3'； 下 游 引 物 ：5'-AGGCTTCCTCCTTGTTGGGT-3'。GAPDH上游引物：5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'；下游 引物：5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'。按照 2-ΔΔCt法计算基因表达水平。引物均购自北京擎科新业生物技术有限公司。实验重复3次，取平均值。

1.2.3 SLPI干扰及过表达质粒构建 利用Puro-PLKO.1-TRC载体构建SLPI敲降慢病毒质粒。首先设计SLPI shRNA序列，其21 bp核心序列为：5'-CCTGA－CACTTGTGGCATCAAA-3'，将合成的shSLPI序列退火后与限制性内切酶（BamHI）酶切后的PLKO质粒载体连接，转化后挑质粒测序，选取测序正确的质粒，扩增抽提后即为SLPI干扰敲除质粒shSLPI。而SLPI过表达质粒则利用PLVX-Puro载体进行构建，主要步骤为设计引物通过PCR方法得到SLPI全长序列，再通过同源重组的方法将SLPI全长序列重组到载体上，经转化、测序及扩增后得到SLPI过表达质粒。

1.2.4 SLPI不同表达水平的SKOV-3稳转细胞株构建 取对数生长期的293T细胞以1×105个/孔的密度接种于6孔板中，置于细胞孵箱培养过夜。第2天将shSLPI质粒及辅助质粒PMD2.G与PSPAX2、shScr敲降对照质粒及辅助质粒PMD2.G与PSPAX2、SLPI过表达质粒及SLPI过表达对照质粒分别加入装有500μl OptiMEM的EP管中，每管含质粒4μg，另取4只EP管分别加入12μl的Lipofectamine 3000，分别在室温下孵育5 min后将两管对应混匀，室温静置20 min，小心加入到293T中，转染6 h后换液，48 h后收集细胞上清液离心并过滤后即得病毒液。

取卵巢癌细胞系SKOV-3以5×104个/孔的密度铺于6孔板中。将上述构建的病毒液与培养基按1∶1分别加入不同孔内，于病毒感染48 h后，利用嘌呤霉素筛选稳转细胞株，得到以下不同SLPI表达水平及对照的SKOV-3稳转细胞株用于后续实验：shScr组（感染shScr病毒，为敲低对照株）、shSLPI组（感染shSLPI病毒，为 SLPI敲低株）、Vector组（感染 Vector病毒，为SLPI过表达株对照）、SLPI组（感染SLPI病毒，为SLPI过表达株）。

1.2.5 SKOV-3稳转细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭相关蛋白表达检测 采用Western blot法。取上述4组SKOV-3稳转细胞株，加入适量细胞裂解液冰上裂解30 min后，13 000 r/min，4 ℃，离心 10 min；吸取上清液，BCA法测定蛋白浓度后加入6×蛋白上样缓冲液于100℃金属浴煮10 min。上样：每孔20μg蛋白上样，SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，5%脱脂牛奶的TBST溶液室温封闭2 h，孵育一抗4℃过夜。一抗检测蛋白包括：SLPI、PCNA、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3/Cleaved Caspase-9、BAX、BCL2 及 MMP-2、MMP-9、Snail1 和 Slug。第 2天孵育辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）化学二抗，化学曝光检测蛋白表达。实验重复3次，取平均值。

1.2.6 不同SLPI表达水平的SKOV-3细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。取上述4组SKOV-3稳转细胞株，消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为4.0×104个/ml，每孔100μl接种于96孔板中，培养48 h后，每孔板可加入10μl CCK-8，37℃后孵育4 h。在M5酶标仪上检测450 nm处吸光度值，通过吸光度比值计算百分比。实验重复3次，取平均值。

1.2.7 不同SLPI表达水平的SKOV-3细胞迁移、侵袭能力检测 采用Transwell实验。取上述4组SKOV-3稳转细胞株，消化成单细胞悬液，用无血清培养基调整细胞浓度为40 000/个（孔·100μl）的细胞悬液。在Transwell小室的上室中加入细胞悬液300μl，同时下室中加入含血清的完全培养基800μl，置于细胞培养箱中培养24 h。PBS清洗Transwell小室后，以4%甲醛固定细胞，结晶紫染色，利用倒置显微镜拍照并统计迁移的细胞数。细胞侵袭能力检测则在Transwell小室中涂基质胶，其余实验步骤同细胞迁移能力实验。实验重复3次，取平均值。

1.2.8 不同SLPI表达水平的SKOV-3细胞凋亡率检测 采用流式细胞仪。取上述4组SKOV-3稳转细胞株，消化成单细胞悬液，按照Annexin V-FITC凋亡细胞试剂盒的说明书对细胞染色，使用流式细胞仪在60 min内检测，cellquest软件分析细胞凋亡百分比。实验重复3次，取平均值。

1.2.9 裸鼠皮下移植瘤实验 取上述4组SKOV-3稳转细胞株，消化成单细胞悬液，用PBS重悬并稀释至浓度为5×106个/ml，将裸鼠麻醉后，在裸鼠皮下注射5×105个/100μl细胞悬液。各组裸鼠数量分别为：shScr组4只裸鼠；shSLPI组5只裸鼠；Vector组5只裸鼠；SLPI组4只。3周后处死裸鼠，取皮下瘤拍照并称重。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件；计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，两组比较采用两独立样本t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SKOV-3、OVCAR-3、TOV-21G、A2780、OV-1063SLPI、ISOE80细胞SLPI mRNA表达水平比较 与ISOE80细胞相比，卵巢癌 SKOV-3、OVCAR-3、TOV-21G、A2780、OV-1063细胞中SLPI mRNA表达水平均升高（均P＜0.05），见表1。后续选取SKOV-3细胞系构建稳定过表达和敲低细胞株进行后续实验。

表1 SKOV-3、OVCAR-3、TOV-21G、A2780、OV-1063SLPI、ISOE80细胞SLPI mRNA表达水平比较

2.2 shScr组与shSLPI组、Vector组与SLPI组细胞增殖率及增殖相关蛋白表达水平比较 CCK-8结果显示，与shScr组相比，shSLPI组细胞增殖率明显降低（P＜0.05）；与Vector组相比，SLPI组细胞增殖率明显升高（P＜0.05）。Western blot结果显示，与shScr组相比，shSLPI组细胞PCNA、Cyclin D1蛋白表达水平明显降低（均 P＜0.05）；与 Vector组相比，SLPI组 PCNA、Cyclin D1蛋白水平明显升高（均P＜0.05）。见表2、图1。

图1 shScr组、shSLPI组、Vector组、SLPI组细胞增殖相关蛋白增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞周期蛋白1（Cyclin D1）表达电泳图

表2 shScr组与shSLPI组、Vector组与SLPI组细胞增殖率比较

2.3 shScr组与shSLPI组、Vector组与SLPI组细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达水平比较 流式细胞术结果显示，与shScr组相比，shSLPI组细胞凋亡率明显升高[（20.9±1.05）%比（3.74±0.12）%，P＜0.05]；与Vector组相比，SLPI组细胞凋亡率明显降低[（1.67±0.09）%比（3.50±0.14）%，P＜0.05]。Western blot结果显示，与shScr组相比，shSLPI组细胞促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3/Cleaved Caspase-9、BAX的表达水平明显升高（均P＜0.05），凋亡抑制蛋白BCL2表达水平明显降低（P＜0.05）；与Vector对照组相比，SLPI组促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3/Cleaved Caspase-9、BAX 的表达水平明显降低（均P＜0.05）；凋亡抑制蛋白BCL2表达明显升高（P＜0.05）。见图 2。

图2 shScr组与shSLPI组、Vector组与SLPI组细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达水平比较 [a为细胞凋亡率比较；b为凋亡相关蛋白表达电泳图（Cleaved Caspase-3为胱天蛋白酶-3；BAX为凋亡调节剂BAX；Cleaved Caspase-9为胱天蛋白酶-9；BCL2为B淋巴细胞瘤-2基因；Actin为肌动蛋白）]

2.4 shScr组与shSLPI组、Vector组与SLPI组细胞迁移率、侵袭率及迁移侵袭相关蛋白表达水平比较Transwell小室迁移和侵袭实验结果均显示，与shScr组相比，shSLPI组细胞迁移率和侵袭率明显降低（均P＜0.05）；与Vector对照组相比，SLPI组细胞迁移率和侵袭率明显升高（均P＜0.05）。Western blot结果显示，与shScr组相比，shSLPI组细胞迁移侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9、Snail 1、Slug表达水平均明显降低（均P＜0.05）；与Vector组相比，SLPI组细胞迁移侵袭相关蛋白 MMP-2、MMP-9、Snail 1、Slug 表达水平明显升高（均P＜0.05）。见图3-4。

图3 Transwell检测shScr组、shSLPI组、Vector组、SLPI组细胞迁移和侵袭能力（a为迁移能力比较；b为侵袭能力比较；结晶紫染色，×100）

2.5 shScr组与shSLPI组、Vector组与SLPI组细胞皮下移植瘤生长情况比较 裸鼠皮下移植瘤结果显示，与shScr组相比，shSLPI组裸鼠皮下移植瘤明显偏小；与Vector组相比，SLPI组裸鼠皮下移植瘤明显增大。瘤重称量结果同样显示，与shScr组相比，shSLPI组裸鼠皮下移植瘤瘤重明显偏小（P＜0.05）；与Vector组相比，SLPI组裸鼠皮下移植瘤瘤重明显偏大（P＜0.05）。见图5。

图4 shScr组、shSLPI组、Vector组、SLPI组细胞迁移侵袭相关蛋白表达电泳图（MMP-2为基质金属蛋白酶2；MMP-9为基质金属蛋白酶9；Snail 1为锌指蛋白SNAI1；Slug为锌指转录因子；Actin为肌动蛋白）

图5 shScr组与shSLPI组、Vector组与SLPI组细胞皮下移植瘤生长情况比较[a为皮下移植瘤照片；b为皮下移植瘤瘤重（g）比较；*P＜0.05]

3 讨论

卵巢癌是目前全球女性癌症相关死亡的第八大原因，全球每年约有14万名女性死于卵巢癌[6]。探讨卵巢癌发生、发展及其转移过程，寻找调控这些过程的关键信号蛋白，针对性地研究基因靶向治疗，是推进临床上卵巢癌诊治水平关键的环节。

SLPI是一种中性白细胞弹性蛋白酶抑制剂，其主要功能是抗蛋白酶和抗炎活性，保护正常黏膜组织免受来自丝氨酸蛋白酶如弹性蛋白酶，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等的降解作用。多项临床研究结果显示，SLPI在乳腺癌、肺癌、前列腺癌及结直肠癌等多种癌症中呈高表达状态，且其高表达与肿瘤患者的预后不良呈正相关[7-8]。本研究通过构建不同SLPI表达水平的卵巢癌细胞株，并比较其增殖、凋亡、侵袭、迁移等细胞生物学行为发现，SLPI高表达可以促进细胞增殖，抑制细胞凋亡并促进体内肿瘤生长，同时此结果在敲低细胞株中得到验证。

迄今未止，关于SLPI基因对卵巢肿瘤的影响相关研究不多。Carlson等[9]研究表明与卵巢良性疾病相比，上皮性卵巢癌患者卵巢组织中SLPI表达显著升高，并且有望成为用于卵巢癌诊断的新的肿瘤标志物。Rasool等[10]研究表明耐药性卵巢癌细胞株中SLPI蛋白表达上调，紫杉醇暴露可上调卵巢癌细胞株中SLPI蛋白表达，并促进卵巢癌细胞耐药。本研究发现SLPI在正常卵巢上皮细胞中表达水平明显低于卵巢癌细胞。而进一步细胞实验结果显示SLPI过表达促进了SKOV3细胞增殖，SLPI敲降则抑制其增殖。Western blot结果显示SLPI过表达促进了SKOV3细胞中增殖相关蛋白PCNA和Cyclin D1的表达，SLPI敲降则抑制其表达。有研究也证实SLPI可以通过促进增殖信号蛋白Cyclin D1的表达，或者抑制胰岛素样生长因子结合蛋白 3（insulin like growth factor binding proteins 3,IGFBP-3）的表达促进肿瘤细胞增殖[11-12]。流式检测术检测细胞凋亡结果发现，SLPI过表达抑制了SKOV3细胞凋亡，敲降则促进了SKOV3细胞凋亡。同样的，蛋白表达检测发现，SLPI过表达抑制了凋亡正相关蛋白BAX、Cleaved Caspase-9的表达，而抑制了凋亡负相关蛋白BCL2的表达，SLPI敲降结果则与之相反。以上结果表明，SLPI可以通过促进肿瘤细胞增殖，抑制其凋亡起促癌基因作用。转移是导致卵巢癌患者死亡的主要原因。SLPI直接抑制弹性蛋白酶及其他丝氨酸蛋白酶，调节MMP、纤溶酶原活性及纤溶酶下游靶向蛋白，从而影响肿瘤细胞侵袭[13]。关于胃癌的研究证明SLPI通过Elk-1信号通路促进MMP-2/9的表达从而促进肿瘤细胞迁移。以上研究表明SLPI可能通过影响肿瘤的增殖、迁移过程影响了肿瘤的发生、发展[14]。本研究过表达和敲降SLPI后检测其对SKOV-3细胞迁移和侵袭能力影响时也发现，SLPI过表达促进SKOV-3的迁移和侵袭，SLPI敲降则抑制了SKOV3的迁移和侵袭。且过表达促进了迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9及Snail1、Slug的表达，敲降则相反。证明SLPI在肿瘤中发挥促肿瘤转移作用。而MMP-2、MMP-9、Snail1及Slug等蛋白与肿瘤细胞上皮间质转化密切相关，提示SLPI可能还可以通过调控肿瘤细胞的其他生物学功能影响肿瘤进程，值得更深入的研究。此外，裸鼠皮下成瘤实验证实了SLPI过表达可促进肿瘤体内增长，而敲低则抑制了肿瘤的增长，SLPI组裸鼠的移植瘤瘤重明显高于对照组，而SLPI敲降则相反。

综上所述，SLPI高表达促进卵巢癌的增殖、迁移和侵袭能力，同时抑制细胞凋亡，在体内卵巢癌恶性进程中发挥着促癌的作用。关于SLPI如何调控卵巢癌细胞增殖和迁移，则需要进一步探讨。