葛根素对肾透明细胞癌786-O细胞生长抑制作用的研究

杨智勇 王晓英 陈永革 周莎莎 魏亚超 李晶 郭志远 祁卫华

肾细胞癌是起源于肾实质的泌尿系统常见恶性肿瘤之一，全球每年新发病例超过40万，发病率约占恶性肿瘤的2%[1]。肾透明细胞癌是肾细胞癌的主要病理类型，占发病总数的80%以上。由于其早期无症状且缺乏特异性诊断标志物，30%的患者确诊时已处于肿瘤中晚期[2-3]。目前，手术切除辅助放化疗是临床治疗肾透明细胞癌的首选方案，但化疗药物不良反应广泛且易产生耐药性，是术后肿瘤复发转移的重要原因之一[4]。

中医药基于辩证论治方法，具有整体调理、标本兼治、不良反应小的优点，在肿瘤治疗方面逐渐得到关注与认可。葛根素是中药葛根的主要活性成分，化学结构属于异黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化等多种生物学活性[5-6]。研究发现，葛根素能够抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，对非小细胞肺癌[6]、结肠癌[7]、乳腺癌[8]等具有一定治疗作用。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt）信号通路对细胞增殖与凋亡具有关键性的调控作用[7-8]。本研究通过观察葛根素对肾透明细胞癌786-O细胞增殖与凋亡的影响，探讨其抑制786-O细胞生长的作用机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 细胞 人肾透明细胞癌786-O细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.2 主要药物与试剂 葛根素购自上海源叶生物科技有限公司（纯度≥99%，批号：B21028）；5-氟尿嘧啶购自美国 Selleck公司（纯度≥99.97%，批号：S1209）；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司（批号：1951038）；胰蛋白酶消化液、链青霉素双抗、FBS购自上海源叶生物科技有限公司（批号：20191213、20190930、20200128）；细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）、增强化学发光（enhanced chemiluminescence,ELC）试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司（批号：CA1210、SW2030）；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、Annexin V-FITC/PI试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司（批号：201911016、202001005、201912011）；细胞周期和细胞凋亡相关蛋白第10号染色体缺失的磷酸酶（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN）、磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）、磷酸化 PI3K（phosphorylated PI3K,p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、周期蛋白激酶抑制因子p27、激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）抗体和山羊抗兔IgG二抗购自北京博奥森生物技术有限公司（批号：bsm-52369R、bs-10276R、bs-5570R、bs-6951R、bs-0876R、bs-0623R、bs-0742R、bs-0081R、bs-0294P）。

1.3 主要仪器 BB15型细胞培养箱为德国Heraeus公司产品；iMark型酶标仪为美国BIO-RAD公司产品；CyFlow Counter型流式细胞仪为德国Partec公司产品；SE300型电泳仪、TE22型转膜仪为美国Hoefer公司产品；5427R型低温高速离心机为德国Eppendrof公司产品。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养、分组与给药 人肾透明细胞癌786-O细胞株复苏后接种于含有10% FBS的RPMI 1640培养基，置于5%二氧化碳、饱和湿度、37℃恒温细胞培养箱中，每2 d更换1次培养基，待细胞覆盖率约80%时进行传代。取对数生长期786-O细胞分别给予DMSO（空白对照组）、终浓度10、20、40 mg/L的葛根素溶液[9]（分别为葛根素10、20、40 mg/L组）和 70 mg/L的5-氟尿嘧啶溶液[10]（5-氟尿嘧啶组）干预。

1.4.2 CCK-8法检测细胞增殖率 各组细胞分别给药干预6、12、24、48 h，经0.25%胰酶消化和重悬后制备浓度1×104个/ml单细胞悬液，100μl/孔接种于96孔培养板，每组设10个复孔，10μl/孔加入浓度10%的CCK-8溶液，继续培养2 h后收集细胞，通过酶标仪检测450 nm处吸光度值（A）。细胞增殖率（%）=（A药物组/A空白对照组）×100%

1.4.3 细胞克隆实验检测细胞克隆形成能力 各组细胞分别给药干预48 h后更换不含药的常规培养基，每3 d更换1次培养基，14 d后弃培养基，PBS溶液浸洗细胞，4%多聚甲醛溶液固定15 min，1 ml/孔加入0.5%结晶紫染液染色30 min，吸去染液并晾干后，显微镜下观察并计数细胞。

1.4.4 流式细胞术检测细胞周期分布 各组细胞分别给药干预48 h后用0.25%胰蛋白酶消化，离心取细胞，75%乙醇溶液固定12 h，经PBS溶液洗涤后滴加PI溶液避光孵育30 min，通过流式细胞仪检测488 nm处PI荧光，分析G0/G1期、S期、G2/M期细胞百分比。

1.4.5 AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 各组细胞分别给药干预48 h后用不含EDTA的胰蛋白酶消化，经PBS溶液洗涤后按照Annexin V-FITC/PI试剂盒操作说明进行处理，通过流式细胞仪分析细胞凋亡水平。

1.4.6 Western blot法检测细胞周期和细胞凋亡相关蛋白表达水平 各组细胞分别给药干预48 h后用0.25%胰酶消化，离心取细胞、冰上裂解30 min后4℃、12 000 r/min离心15 min取上清液，BCA法检测总蛋白浓度，95℃水浴10 min使蛋白变性，行SDS-PAGE电泳分离蛋白、湿转法转PVDF膜、丽春红溶液染色、5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，洗膜后滴加目标蛋白抗体、β-actin抗体4℃孵育过夜，洗膜后滴加IgG二抗室温孵育1 h，洗膜后滴加ECL显色，以β-actin为内参，通过条带灰度值计算目标蛋白相对表达水平。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件；计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肾透明细胞癌786-O细胞增殖率比较 随着葛根素10、20、40 mg/L或5-氟尿嘧啶干预时间的延长，786-O细胞增殖率逐渐降低。干预48 h后，与空白对照组相比，葛根素10、20、40 mg/L组与5-氟尿嘧啶组786-O细胞增殖率明显降低（均P＜0.01），且葛根素40 mg/L组786-O细胞增殖率明显低于5-氟尿嘧啶组（P＜0.01）。见图 1。

图1 各组肾透明细胞癌786-O细胞增殖率比较（a为干预6、12、24、48 h细胞增殖率变化；b为干预48 h细胞增殖率比较；与空白对照组比较，**P＜0.01；与5-氟尿嘧啶组比较，△△P＜0.01）

2.2 各组肾透明细胞癌786-O细胞克隆形成能力比较干预48 h后，与空白对照组相比，葛根素20、40 mg/L组和5-氟尿嘧啶组786-O细胞克隆数目明显降低（均P＜0.01），且葛根素40 mg/L组786-O细胞克隆数目明显低于 5-氟尿嘧啶组（P＜0.01）。见图 2（插页）、3。

图2 各组肾透明细胞癌786-O细胞克隆显微镜下所见（a为空白对照组；b为葛根素10 mg/L组；c为葛根素20 mg/L组；d为葛根素40 mg/L组；e为5-氟尿嘧啶组；结晶紫染液染色，×100倍）

图3 各组肾透明细胞癌786-O细胞克隆形成能力比较（与空白对照组比较，**P＜0.01；与5-氟尿嘧啶组比较，△△P＜0.01）

2.3 各组肾透明细胞癌786-O细胞周期分布比较 干预48 h后，与空白对照组相比，葛根素20、40 mg/L组和5-氟尿嘧啶组G0/G1期细胞百分比升高，S期细胞百分比降低（均P＜0.01），G2/M期细胞百分比比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与5-氟尿嘧啶组相比，葛根素40 mg/L组G0/G1期细胞百分比明显升高且S期细胞百分比明显降低（P＜0.05或0.01），G2/M期细胞百分比比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

图4 各组肾透明细胞癌786-O细胞周期分布比较（与空白对照组比较，**P＜0.01；与 5- 氟尿嘧啶组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01）

2.4 各组肾透明细胞癌786-O细胞凋亡率比较 干预48 h后，与空白对照组相比，葛根素 10、20、40 mg/L组和5-氟尿嘧啶组786-O细胞凋亡率均升高（均P＜0.01），其中葛根素40 mg/L组786-O细胞凋亡率明显低于5-氟尿嘧啶组（P＜0.05）。见图5。

图5 各组肾透明细胞癌786-O细胞凋亡率比较（与空白对照组比较，**P＜0.01；与 5- 氟尿嘧啶组比较，△P＜0.05）

2.5 各组肾透明细胞癌786-O细胞PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平比较 干预48 h后，与空白对照组相比，葛根素10、20、40 mg/L组和5-氟尿嘧啶组786-O细胞PTEN表达水平上调，p-PI3K、p-Akt蛋白表达下调（均 P＜0.05或 0.01），PI3K、Akt磷酸化比率降低（均P＜0.05或0.01）；且与5-氟尿嘧啶组相比，葛根素40 mg/L组PTEN表达水平上调，p-PI3K、p-Akt表达水平下调（均 P＜0.05或 0.01），PI3K、Akt磷酸化比率降低（均P＜0.05）。见图6-8。

图6 各组肾透明细胞癌786-O细胞PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达电泳图（PTEN为第10号染色体缺失的磷酸酶；PI3K为磷脂酰肌醇3-激酶；p-PI3K为磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶；Akt为蛋白激酶B；p-Akt为磷酸化蛋白激酶B；a为空白对照组；b为葛根素10 mg/L组；c为葛根素20 mg/L组；d为葛根素40 mg/L组；e为5-氟尿嘧啶组）

图7 各组肾透明细胞癌786-O细胞PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平比较（PTEN为第10号染色体缺失的磷酸酶；PI3K为磷脂酰肌醇3-激酶；p-PI3K为磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶；Akt为蛋白激酶B；p-Akt为磷酸化蛋白激酶B；与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与 5- 氟尿嘧啶组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01）

图8 各组肾透明细胞癌786-O细胞PI3K、Akt蛋白磷酸化比率比较（a为PI3K蛋白磷酸化比率比较；b为Akt蛋白磷酸化比率比较；与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与5-氟尿嘧啶组比较，△P＜0.05）

2.6 各组肾透明细胞癌786-O细胞cyclin D1、p27、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平比较 干预48 h后，与空白对照组相比，葛根素10、20、40 mg/L组和5-氟尿嘧啶组786-O细胞cyclin D1表达水平下调，p27、Cleaved Caspase-3表达水平上调（均P＜0.01）；与5-氟尿嘧啶组相比，葛根素40 mg/L组Cleaved Caspase-3、p27表达水平明显上调且cyclin D1表达水平明显下调（均 P＜0.05或 0.01）。见图 9、10。

图9 各组肾透明细胞癌 786-O细胞 cyclin D1、p27、Cleaved Caspase-3蛋白表达电泳图（cyclin D1为细胞周期蛋白D1；p27为周期蛋白激酶抑制因子p27；Cleaved Caspase-3为激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；a为空白对照组；b为葛根素10 mg/L组；c为葛根素20 mg/L组；d为葛根素40 mg/L组；e为5-氟尿嘧啶组）

图10 各组肾透明细胞癌786-O细胞 cyclin D1、p27、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平比较（cyclin D1为细胞周期蛋白D1；p27为周期蛋白激酶抑制因子p27；Cleaved Caspase-3为激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；与空白对照组比较，**P＜0.01；与5-氟尿嘧啶组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01）

3 讨论

细胞增殖失控与凋亡受阻是肿瘤细胞异常生长的重要因素，所以抑制细胞增殖和促进细胞凋亡是肿瘤治疗的重要途径。近年来，随着振兴中医药发展战略的实施，中药抗肿瘤得到普遍关注，应用逐渐广泛。葛根是以豆科植物野葛的干燥根入药，是一味长期应用于临床的中药，收入《中国药典》。葛根素是中药葛根的主要活性成分，目前临床上主要用于缺血性心脑血管疾病的治疗，近年来葛根素抗肿瘤活性得到广泛关注。本研究以人肾透明细胞癌786-O细胞为受试细胞，并以临床治疗肾透明细胞癌一线化疗药物5-氟尿嘧啶作为阳性对照药物开展研究，结果显示经葛根素20～40 mg/L或5-氟尿嘧啶干预能够显著降低786-O细胞增殖率和细胞克隆数目，提高786-O细胞凋亡率，并且葛根素40 mg/L组效果优于5-氟尿嘧啶组，说明葛根素具有抑制人肾透明细胞癌786-O细胞增殖并促进其凋亡的作用。

细胞周期正常运转是细胞增殖的基础，一个完整的细胞周期分为G0/G1期、S期、G2/M期三个阶段。徐楗荧等[11]研究发现通过抑制G1期-S期转换能够阻止细胞有丝分裂而阻滞细胞周期，可作为抗肿瘤药物的靶点。有多种蛋白参与细胞周期的运转过程，其中cyclin D1主要在G1期表达，能够通过刺激腺病毒E2启动子结合的转录因子表达与释放，进而驱动G1期到S期运转。Zheng等[12]研究发现cyclin D1过度表达能够缩短细胞周期，是导致细胞增殖失控引发癌变的重要因素。周期蛋白激酶抑制因子p27能够与cyclin D1结合而抑制其活性，对细胞周期表现为负性调控作用[13]。本研究结果显示，经葛根素20～40 mg/L或5-氟尿嘧啶干预能够明显下调786-O细胞cyclin D1表达并上调p27表达，并且葛根素40 mg/L组效果优于5-氟尿嘧啶组，这可能是葛根素抑制786-O细胞增殖的重要分子机制。

细胞凋亡是由多种信号通路和蛋白参与调控的复杂过程，Cleaved Caspase-3参与细胞凋亡的启动及全过程的调控，在细胞凋亡过程中发挥重要调节作用[14]。肿瘤细胞异常快速增殖过程中导致局部缺氧，病理性刺激线粒体膜通道异常开放导致细胞色素C过度释放，细胞色素C能够诱导Caspase-3转化为Cleaved Caspase-3而被激活[15]。本研究结果显示，经葛根素20～40 mg/L或5-氟尿嘧啶干预能够显著上调786-O细胞Cleaved Caspase-3表达，并且葛根素40 mg/L组效果优于5-氟尿嘧啶70 mg/L组，这可能是葛根素促进786-O细胞凋亡的重要分子机制。

Akt为PI3K的下游基因，p-PI3K能够诱导Akt磷酸化（p-Akt）而被活化，PI3K/Akt通路在细胞增殖与凋亡过程中具有重要调控作用[16]。PTEN是一种抑癌基因，能够抑制PI3K磷酸化而抑制其活化，所以PTEN具有抑制PI3K/Akt信号通路的作用[17]。既往研究发现p-Akt具有诱导Caspase-3活化并上调Cyclin D1表达、下调p27表达的作用[18]。本研究结果显示，经葛根素20～40 mg/L或5-氟尿嘧啶干预能够显著上调786-O细胞PTEN表达并下调p-PI3K、p-Akt表达，降低PI3K、Akt磷酸化比率，并且葛根素40 mg/L组效果优于5-氟尿嘧啶70 mg/L组，提示葛根素具有上调PTEN表达而抑制PI3K/Akt通路的作用。

综上所述，葛根素能够通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡而抑制肾透明细胞癌786-O细胞生长，可能与诱导PTEN表达而抑制PI3K/Akt通路有关。